原生质体的培养
1.原生质体的分离与纯化
原生质体培养的意义
(1再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。
原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。
(2用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。
一、原生质体(protoplast的分离
（一）材料来源
原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、茄子、番茄等70种植物的原生质体再生成完整的植株。此外，原生质体融合，体细胞杂交的技术也得到广泛的应用。
（二）分离方法1.机械分离法
1982年，Klercker第一次用机械方法从Stratiotsaloides中获得原生质体.他们的做法是首先使细胞发生质壁分离,然后切开细胞壁释放出原生质体.
2.酶法分离(1酶的种类及特点
构成植物细胞壁的三个主要成分是：
①纤维素酶类：占细胞壁干重的25％至50％不等。②半纤维素酶类：平均约占细胞壁干重的53％左右。
③果胶酶类：一般占细胞壁的5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素
酶和果胶酶。
④崩溃酶：一种粗制酶
⑤蜗牛酶：主要用于分离小孢子的原生质体。
纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，主要含有纤维素酶C1，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用，还含纤维素酶Cx，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，总体作用是降解纤维素，得到裸露的原生质体。
果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。半纤维素酶制剂可以降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。此外，还有蜗牛酶，主要用于花粉母细胞和四分体细胞。
ZA3-867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的复合物，含有纤维素酶(包括C1、Cx、B-葡萄糖苷酶等，果胶质，半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。
日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，可先用果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶处理降解细胞壁。即二步法降解。
(2酶液的配制
①酶的配比及浓度(见表7-1。②渗透稳定剂及pH。
植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。渗透压大些有利于原生质体的稳定，但也有可能阻碍原生质体的分裂。
因此，在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。常用的两种系统为：①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40～0.80mol／L。本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；②盐溶液系统：包括KCl、MgS04和KH2PO4
