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发布时间：2015-10-26   来源：文档文库   
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通过叠氮-炔基点击反应和香豆素染料偶联化合物碱基的特殊荧光熄灭反应进行带有辛二炔侧链的8-氮-7-去氮鸟嘌呤的合成、功能的研究
摘要
合并8-氮杂-7-脱氮-2＇-脱氧鸟苷的7-（辛-1,7-二炔基）衍生物的寡核苷酸（2d）通过固相合成制得。2d的侧链通过Sonogashira交叉耦联反应引进，亚磷酰胺化合物（3a,3b）通过反应有机合成。与那些纳入非官能化8-氮杂-7-脱氮-2＇-脱氧鸟苷(2a的化合物相比，包含2d的复合物更加稳定，这表明这些侧链在双链DNA有空间的自由。核苷2d以及包含2d的寡核苷酸通过汉斯基--梅尔达尔--夏普勒斯点击反应与非荧光性质的3-叠氮-7-羟基香豆素（15）结合。吡唑并[3,4-d]嘧啶核苷类共轭化合物16比相应的吡咯[2，3-d]嘧啶衍生物17显示了一个更高的荧光强度。有人发现染料共轭化合物17的熄灭在单体阶段强于单链和双链DNA阶段。当核苷碱基是这一复杂化合物的一部分时，显示碱基染料联系复合物在单体状态比在DNA链中更有利。与庞大的染料结合的侧链也存在于DNA双链中，从而形成比标准DNA稍微稳定的混合物。
引言
汉斯基--梅尔达尔--夏普勒斯点击反应已成为编写多种新的分子与简单的反应条件下执行各种功能的一种方便、有效的方法。该反应与最常见的生物分子的取代基和化学选择性在铜（I）催化下的反应不是完全相同的。因此，该种方式在药物设计、分子诊断聚合物合成，材料科学，化学和生物化学的其他领域应用中特别有吸引力。
最近，我们报道了掺入7-脱氮-7-（辛-1,7-二炔基）-2＇-脱氧鸟苷（1）寡核苷酸的合成（嘌呤编号用于在结果和讨论部分）。通过汉斯基--梅尔达尔--夏普勒斯点击反应，承载终端三键结合处的侧链与各种叠氮化合物包括染料3-叠氮基-7-羟基香豆素结合。分光镜下的研究表明，当DNA核苷属于吡咯[2，3-d]嘧啶的级别时，荧光熄灭强烈。资料显示一个电子从核苷碱基转移到染料部分。因此，预计有不同氧化还原电位的其他碱基可能不显示这些缺点。吡唑并[3,4-d]嘧啶核苷提供使它们适用的替代系统的潜能。它们显示出类似的碱基配对特性，并且可以在官能的7位上发挥作用。8-氮杂-7-脱氮嘌呤（吡唑并[3,4-d]嘧啶）核苷已被纳入包括7-丙炔基和7-卤代衍生物的DNA中。它表明了8-氮杂-7-脱氮-2＇-脱氧鸟苷残留物2a-c形成了稳定的包含脱氧胞嘧啶的碱基对，脱氧胞嘧啶给予7位取代基更大的立体自由，从而更好地容纳在双链DNA的大沟中。一般，7-取代的核苷比非官能化的核苷形成更稳定的双链体。因此，吡唑并[3,4-d]嘧啶核苷可以被认为是嘌呤核苷形状模拟物，这种模拟物不会干扰DNA双链体结构。
这篇手稿报告了8-氮杂-7-脱氮-7-（辛-1,7-二炔基）-2＇-脱氧鸟苷（2d）的合成，以及它转换成亚磷积木（3a，b）的过程以及它们在固相寡核苷酸合成（图1）的应用。关于碱基配对和荧光性能的研究应用于掺入核苷2d的寡核苷酸改造中。根据方案1，叠氮化物 - 炔'点击反应用于具有末端三键的侧链的核
苷和寡核苷酸的3-叠氮基-7-羟基香豆素的染料缀合反应进行了研究。寡核苷酸香豆素染料缀合物的荧光增强效应被预测，因为寡核苷酸含有吡唑并[3,4-d]嘧啶染料偶联物相比吡咯并[2,3-d]嘧啶衍生物的DNA中。

结果和讨论
1.核苷的合成和特征
7碘化的8-氮杂-7-脱氮-2＇-脱氧鸟苷2b作为起始原料合成亚磷酰胺化合物3a，3b。化合物2b通过Sonogashira交联耦合反应合成衍生物2d（方案2）。反应在无水DMF中进行，且反应体系中需要有Et 3 N, [Pd 0 (PPh 3 4 ] 和碘化铜，以1,7-辛二炔五倍的量反应。由于过度二炔化合物，只有终端碳碳三键起功能化作用，化合物2d被分离出52％产率。接着，衍生物2d中2-氨基被保护，不管是用N，N-二甲基氨基亚甲基或异丁基残余物，得到类似的保护的中间体4a或4b产率（88％和89％）。两种化合物在标准反应条件下转化为5＇-O-DMT-衍生物5a和5b。通过磷酸化作用反应产生亚磷酰胺化合物3a和3b（各自产率分别为63％和72％）。
所有化合物通过无论是元素分析或质谱，1 H和13 C-NMR谱分析，特征都较明显。13C-NMR谱化学位移列于表1中，1 H- 13 C-偶合常数 来自于1 H-13 C门控去耦谱（见表6进行测定，
实验部分）。这些信号都与丙炔基化合物的文献参考值一致。辛-1,7-二炔基侧链的完整结构通过13 C-NMR谱确认，显示了亚甲基的四个信号 (27.1, 27.0, 18.3 和17.3 ppm和三键碳的四个信号(2d: 71.4,73.2, 84.4, 100.1 ppm; 表1，并且通过极化转移（DEPT- 135）谱得到原始增强的反相信号加以确认。由此可以得出结论，三键是不受钯辅助的Sonogashira交叉偶联（丙二烯形成）的影响。

吡唑并[3,4-d]嘧啶核苷显著地显示改变的pKa数值，相比于吡咯并[2,3-d]嘧啶或嘌呤对应一个值。因此，化合物2d的pKa数值紫外分光光度法测定，并且和7-脱氮嘌呤和8-氮杂-7-脱氮嘌呤核苷现有数据相比（表S1，见支持信息）。代表滴定化合物2d的轮廓如图S1（支持信息）。从表S1的数据显而易见的是吡唑[3,4-d]嘧啶核苷的内酰胺类质子酸性比那些吡咯并[2,3-d]嘧啶核苷的质子强。该7位取代基几乎没有影响pKa值，这不同于在此条件下的5-取代嘧啶核苷，如不同2＇-脱氧尿苷衍生物受到侧链的电子性质的强烈影响。 2. 寡核苷酸的合成、特征和二聚体稳定性
我们报告了5-取代嘧啶的取代基的影响和7-取代的含卤7-脱氮嘌呤或炔基上的双链体的稳定性。它表明，带有溴或碘取代基和丙炔基并且附着于吡咯并[2,3-d]嘧啶7-位侧链或吡唑并[3,4-d嘧啶的核苷类似物很好地容纳在大的DNA的槽中，并且通过稳定'dG-DC'碱基对增加双链体的热稳定性。虽然具有一个三键和3-6个碳原子的7-炔基链导致了双链DNA的稳定，但由于增加的疏水特性，更长链变得不稳定。最近，我们科研团队证明带有两个三键像辛二炔的残留物或炔醚部分的长链连接体在对双链体稳定性表现出积极的影响，类似于丙炔基的残留物的影响。此类连接体的优点是附加终端三键的存在，这增强了连接处的亲水特性。水分子可以结合到侧链。我们预计水和三键之间有氢键存在。 为了评价对双链体稳定性和荧光性质的基本改造的潜能，寡核苷酸通过使用亚磷酰胺3a和3b的固相合成以及标准积木制备。它们的合成在1微摩尔规模条件下采用亚磷酰胺化学方法进行。耦合产率始终高于95％。在25％含水的NH3中，60◦C条件下进行18-24小时的低聚物的脱保护基。所述寡核苷酸之前被净化，然后通过反相HPLC脱三苯基。寡核苷酸的碱基组成被串联酶解与蛇毒磷酸二酯酶，接着碱性磷酸酶在0.1摩尔每升三倍-盐酸缓冲液（pH8.5）测定在37◦C（详见实验部分）。寡核苷酸的同源性通过MALDI-TOF质谱法确认。所检测到的组分分别与所述计算值（表7）具有良好的一致性。


方案2 试剂和条件：ⅰ）辛基-1,7-二炔，[Pd 0 [P(Ph 3 4 ], CuI, DMF, Et 3 N,，室温，12小时; （ⅱ）N，N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛，甲醇，室温，2小时（ⅲ）HMDS，室温，3小时; （iv）i-Bu 2 O, 室温，过夜; （v）甲醇，1小时（ⅵ）4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷，无水吡啶中，（i-Pr）2 EtN，室温;（ⅶ）2-氰乙基-N，N二异丙基氯代亚磷酰胺，无水的CH 2 Cl2中，(i-Pr 2 EtN,，室温。

2d的单个和多个结合部位，在参考二聚体5＇d（TAG GTCAAT ACT）（6）和3＇-d（ATC CAG TTA TGA）（7）的各种位置内’更换dG残基被发现。如表2所示，脱氧鸟嘌呤的替换由核苷2d的结果中，每个改变导致2-3◦Ç的Tm值的增加。这些数值接近于一些寡核苷酸双链体的熔点数值，这些寡核苷酸双链体在有着双面稳定倾向的相同位置上包含有8-氮杂-7-脱氮-7-丙炔基 - 脱氧鸟嘌呤的单体（图2c）或7-脱氮-7-辛-1,7-二炔基-脱氧鸟嘌呤的单体（1）。因此，需要辛基侧链的空白位置对DNA双链体的稳定性有一个积极的影响，正如已经观察到的丙炔基残基一样。（2c=2d>1）
3. 通过胡伊斯根-梅尔达尔-夏普勒斯【2 +3]环加成反应合成的带有3-叠氮基-7-羟基香豆素（15）基团的核苷和寡核苷酸的功能化作用
核苷2d以及由所述叠氮化物 - 炔“点击反应”合成的寡核苷酸5＇-d（AGT ATT2dAC CTA）（12）和5＇-d（A2dT ATTGAC CTA）（13）的染料官能化作用被发现。带有终端三键的辛基-1,7-二炔基核苷2d被非荧光性的香豆素叠氮化合物15赋予官能化作用，这种作用发生在乙醇 - 水混合物中，以形成产率为90％的“点击”反应加合物16，同时需要抗坏血酸钠和硫酸铜作为催化剂进行使用（方案3）。详情参见实验部分。该13 C-NMR谱显示不存在终端碳碳三键原子的信号，并且1,2,3-三唑基部分新出现的双键信号在 δ= 122.9 ppm以及δ= 146.8 ppm的表5）得到确认。由于空间位阻，没有观察到一个具有双官能化作用的第二位三键。缀合物16的结构以13 C-NMR谱和JC，H偶合常数为基础进行分配（表5和表6，见实验部分）。染料结合物16侧链的13 C-NMR化学位移几乎与7-脱氮-2＇-脱氧鸟嘌呤核苷香豆素缀合物17的化学位移完全相同（方案3）。在两种情况下，三唑-C 5，H-C 5的Jch偶合常数是199赫兹。此外，三唑环碳的共振通过1 H-NMR、门控去耦1 H -13 C光谱法以及DEPT-135 NMR光谱法得到清楚的确认。
在8-氮杂-7-脱氮-2＇-脱氧鸟嘌呤核苷UV光谱中，化合物2d的7- 辛二炔侧链具有很强的荧光特性。UV数据示于表3中显示和谱在图2中给出。带有炔基的核苷的短波长的最大值从254蓝移至243纳米，与非官能化化合物2a或碘代衍生物2b相比。点击反应的产物16和17的UV光谱是化合物1或2d，以及香豆素叠氮化物15、和1,2,3-三唑基部分（图2a）的UV光谱的联和值。因此，该偶联物可以很容易地在甲醇溶液中在346纳米条件下，通过香豆素结构的长波长的最大吸收值得到确认。这也适用于结合了染料缀合物16（在水中356纳米）的寡核苷酸。
接下来，环加合“点击”的反应用纯化的寡核苷酸5＇-d（AGT ATT 2dAC CTA）（12）和5＇-d（A2dT ATT GAC CTA）寡核苷酸的5 A260 结构单元在寡核苷酸水平表现出来，上述两个寡核苷酸每个都包含一个8-氮杂-7-脱氮-7-（辛-1,7-二炔基）-2＇-脱氧鸟嘌呤核苷残基。两个寡核苷酸分别具有非荧光性香豆素叠氮化物15的功能化作用。反应在水溶液（H 2 O-叔丁醇-DMSO）中进行，并
且在CuSO4 -TBTA（三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基甲基]胺）（1：1）的混合物，TCEP（三（羧乙基）膦）和碳酸氢钠存在条件下（流程4）。碳酸氢钠对于完成反应是必要的，在12小时范围内，可以得到强荧光性寡核苷酸5＇-d（AGTATT 16AC CTA）（ 18）和5＇-d（A16 T ATT GAC CTA）（19）。详情参见实验部分。所述寡核苷酸通过反相HPLC纯化，通过MALDITOF质谱（表7），紫外线光谱（图2b）以及由高效液相色谱得到洗脱曲线进行定性（方案4）。寡核苷酸19的UV / VIS光谱显示两个最大值，这可以归因于核碱基在260nm处的特征吸收和香豆素染料在356纳米的特征吸收。
寡核苷酸13和19的组成分析用蛇毒磷酸二酯酶（Crotallus adamanteus，EC3.1.15.1）和碱性磷酸酶（大肠杆菌，EC3.1.3.1）进行。化合物的组成结构显示在摘要的HPLC图表中，表明包括改造核苷2d以及“点击”反应产物16的所有单体组分在寡核苷酸合成和偶联时不受影响。正如预期的那样，通过增加侧链的长度，例如从丙炔基衍生物2c到辛二炔化合物2d，化合物的亲脂性增加，这在反相高效液相色谱图中显示出来（图S2中，见支持信息）。亲水香豆素残基的引入使得缀合物比原料2d具有较低亲脂性;因此，结合化合物16比2d迁移速度快。从人造改良核苷混合物中获得的信息对酶促消化的峰值分配是有利的（图3）。
4. 核苷和寡核苷酸3-叠氮-7-羟基香豆素共轭化合物的荧光特性，以及DNA双链的稳定性
与嘧啶核苷的染料结合物相比，吡咯并[2,3-d]嘧啶核苷的染料结合物明显地显示较低的荧光性，这种现象被研究7-羟基香豆素的报告团队所发现。现在对化合物16的荧光特性进行了研究，并在pH8.5条件下与17进行比较。在碱性条件下（pH为8.5），7-羟基香豆素染料主要以阴离子形式存在。两种化合物显示出类似的激发最大值（染料16（398 纳米），染料17（393纳米）），以及在478 纳米和477 纳米各自的发射最大值，都在pH 8.5, 0.1M 三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲液条件下测定（图4a和b）。由于溶解度的原因，香豆素1,2,3-三唑基结合物16和17溶解在0.5毫升DMSO中，然后用99.5毫升的0.1M的三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲液，pH8.5的溶液稀释。在所有实验中，核苷染料缀合物的浓度是相同的(9.4 ×10 -3 摩尔每升 。
在图4b中，显而易见的是，在8-氮杂-7-脱氮-2＇- 脱氧鸟苷染料缀合物16比缀合物17显示更强的荧光特性（见图4a）。这在图4c的直接比较中可以清楚地证明，图4c显示16的荧光最大吸收值比17大约高10倍。接下来，1和2d的在Cu（Ⅰ）催化条件下的叠氮化物 - 炔环加成反应在荧光数值测量后随之进行，1和2d含有非荧光特性的3-叠氮基-7-羟基香豆素（15），核苷染料缀合物17和16也从15衍生得到（图4d）。显而易见的是，在吡咯并[2,3-d]嘧啶染料缀合物17的形成过程中，只有一个小的荧光值增加可以被观察到，然而，在吡唑并【3,4-d]嘧啶染料缀合物16的形成过程中，产生了一个强的荧光值的增加。
接着，对寡核苷酸18和19的荧光特性进行了研究，寡核苷酸18和19含有作为单体构件的1,2,3-三唑香豆素衍生物16。单链寡核苷酸18和19的荧光光谱都显示出强大的荧光特性，在479纳米处出现发射最大值，在401纳米处出现激发最大值（图5a和c）。在与没有改造的互补链杂交过程中，双链5＇-d（TAG GTC AAT ACT）（6）·3＇-d（ATC CAG TTA T16A）（19）和5＇ - D（TAG GTC AAT ACT）（6）·3＇-d（ATC CA 16 TTA TGA）（18）形成在16所处的地方，
或者接近于5＇-末端（图5b），或者在一个中心位置（图5d）。在双螺旋的形成过程中没有观察到明显的荧光效应的改变，这一形成过程导致单链和双链DNA产生几乎相同的荧光强度。这一观察结果与相关的寡核苷酸吡咯并[2,3-d]嘧啶核苷的香豆素缀合物17所产生的现象是相反的。在化合物17二聚体的形成过程中，发现了香豆素染料荧光强度的强烈减少（85％）。
含有8-氮杂-7-脱氮-2′-脱氧鸟苷染料结合物16的单链寡核苷酸5′-d（A16Ť ATT GACCTA）（19）容易被蛇毒磷酸二酯酶中的磷酸二酯酶水解（在0.1M的Tris-HCl缓冲液中，pH8.5）。在一个固定的激发波长（396nm）条件下荧光波长被测得为479 nm。在20分钟内，观察到寡核苷酸19荧光强度增加了3.4倍。用碱性磷酸酶去磷酸化（37◦C孵育9小时）没有导致进一步荧光变化。当这些实验是用于包含7-脱氮-2′-脱氧鸟苷染料结合物17的寡核苷酸5′-d（A17ŤATT GAC CTA）（20）时，观察到完全不同的现象。包含7-脱氮-2′ - 脱氧鸟苷染料共轭17的寡核苷酸20产生一个强有力的荧光熄灭。
虽然上述结果表明了在反应过程中类型12和13的结构的形成，我们不能够通过31P 核磁共振谱来观察这些中间体，甚至在-80℃下。在不存在醇，加入碘在四氢呋喃或乙腈中H-硫代磷酸乙酯2a的溶液导致了难处理的产品的混合物（31P NMR实验）表明了硫代磷酸酯（改前面的此词）中间体的聚合。
然而，由于偏磷酸盐是已知的，以与叔胺形成稳定的加合物，我们试图推定硫代磷酸酯 8和吡啶或1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷（DABCO）（图3，化合物14和15）以产生类似的物质。为此，碘在吡啶中的溶液（1.1当量）加入到含乙基的H-硫代磷酸酯2a中，在相同溶剂，和室温下进行。反应混合物的31P NMR光谱显示原料2a的立即消失，和一个形成的纯的产品的谐振在56.0 ppm处，其中在其化学位移的基础上被分配到预期的乙基硫代磷酸酯-吡啶加合物14（R = Et）。要验证此结构，将反应混合物用ESI质谱分析，的确，除其他信号外，揭示了这种加合物预期的质量峰。化合物14（R = ET）似乎比醇更加具有抵抗性，和至少在10当量的甲醇，乙醇，或异丙醇不得不用于纯的硫代磷酸二酯10a-10c的转化。与叔丁醇反应缓慢，导致显著副产物的形成。如先前报道，硫代磷酸酯14的吡啶加合物仅和良好的亲核试剂有效的反应，例如氟离子或胺。
乙基硫代磷酸酯-DABCO加合物15（R = Et）生成类似于物质14，在四氢呋喃中有DABCO（10当量）的存在下H-硫代磷酸酯2a与碘（1.1当量）反应。加合物15（R = Et）在这些条件下被纯净地形成，由31P NMR谱和质谱分析。化合物15（R = Et）是在反应混合物中相对稳定;然而，当用过量的醇（10当量）处理时，它容易被转化为相应的硫代磷酸二酯（10a-10d）。
总结一下这一部分，化学和经上面讨论提供的立体化学实验强有力的支持了调查的氧化磷酸化中的单体硫代磷酸酯8的中间体，并且因此H-硫代磷酸单酯与碘的反应可以构成一种新型的，有效的生成这种具有亲电性的磷物质的方法。
对于硫代，二硫代和硫代硒酸酯的形成机制。虽然，到目前为止，该研究报告介绍，在讨论的反应中提供了强有力的支持硫代磷酸酯的中间体，他们并没有解决这些物质是通过哪条途径形成的问题。我们考虑两种可能的途径，路径A和路径B，这可能生成硫代磷酸酯8（方案2），并在这样的背景下出现两个问题：（ⅰ）为什么是一个特定的机制，并优先于其他机制（ii）当反应物或条件改变时，从一个机制到另一个过渡的性质是什么？在我们的情况下，这些问题的答案可以澄清以上问题，为什么类型1的H-磷酸酯单酯与碘反应不能被氧化？而其他硫族类似物（类型2-4的化合物）在同样的条件下可以进行快速的氧化。
这应该有利于揭示在化合物2中的硫的最初碘化的机制。另一方面，增加的H-硫代磷酸酯 P-H键的酸度，相比于其氧对应部分，可以揭示与亚磷酸二价阴离子5的产生的一种机制路线，在其在磷中心与碘反应（路径A，方案2）之后发生。路径B的一个有趣的特点是，它会构成一个新的机械途径，可以形成偏磷酸类似物。一般偏磷酸和它们的类似物从P（V）承载良好的离去基团和一个内部的亲核试剂的衍生物产生，示于方案3。对于环状磷化合物，Z和X是环系统的一部分，和偏磷酸的破碎在热解条件下发生。生成偏磷酸的其它的方法，如磷基团的碎裂，混合磷酸甲酸酐或2,4-双（4-甲氧基苯基）-2,4-二硫代1,3,2,4-二硫杂（劳森试剂），也已经开发了;然而，它们的适用范围限于特定偏磷酸类似物。
在对比所有这些方法中，经路径B 硫代磷酸酯8（方案2）的生成发生在氧化步骤。机理上，这意味着碘氧化H-硫代磷酸酯2中的第一硫以形成硫碘磷酸衍生物7，并且这个P（III）的中间体发生内部歧化这导致磷原子的氧化和硫代磷酸酯8的生成。
有关于类型1的H-磷酸单酯的敏感性统一的的实验数据，以及它们的硫代（2），二硫（3），和硒代（4）的类似物（图1）与碘的氧化，我们研究H-磷酸酯（1a），H-硫代磷酸酯（2b）中，H-二硫代磷酸酯（3a）中，和H-硫代硒酸酯（4a）在乙醇（10当量），碘（1.1当量）和Et 3 N（3当量）的存在下，在四氢呋喃为溶剂，室温中反应（方案4）。对于所有的H-磷酸酯衍生物，但1a中，一个快速（<15秒）和纯的转化成相应的磷酸二酯类似物（11b中，18，19;方案4），在这些反应条件下观察（31P NMR实验）。由于H-磷酸酯1a即使经过长时间的反应时间（1小时）仍保持不变，看来至少需要一个具有高亲和力的易亲电的（碘）的硫族元素原子，即：硫或硒，必须附连到磷原子中心上以容易地氧化为P（V）的化合物。
要证实是否H-硫代磷酸酯2b，H-二硫代磷酸酯3a，和H-硫代硒酸酯 4a与碘的反应是通过相同类型的中间体，即，相应的硫代，二硫代和硫代硒酸酯的进行，在区分实验中，我们试图捕获这些物质中的相应的吡啶加合物的存在。实际上，在将碘加到2b，3a和4a的在吡啶溶液中，31P NMR谱揭示类型14预期的偏磷酸加合物的形成，如（图3）。
在原则上，虽然有这些实验的支持，路径B（硫族原子与碘的氧化作为初始反应步骤），我们不能排除路径A中，通常因硫或硒的在磷中心的存在会增加的P-H质子的酸性（参见上文）。
为了评估这些反应中碘对硫和硒亲和力的重要性，我们将注意力转向其他的氧化剂，和亲电中心，是以硬度和柔软性（图3）为依据的光谱。因此，除了溴，不同的碳的四卤化物进行了测试，碳的四卤化物被称为在阿瑟顿-托德反应中有效的氧化剂。
作为模型化合物，选择了乙酯H-硫代磷酸酯2a，并且它可以与加入了Et 3 N（3当量）的乙醇（10当量），且在四氢呋喃中加入适当的氧化剂，室温下（图3）反应。在31P NMR谱后游览反应的进展。
从图3中的数据可以看出，所有的氧化剂研究，除四氯化碳，成功地促进了乙醇氧化硫代磷酸化物。四氯化碳被称为硬的供体，氯离子，可有效地氧化H-磷酸二酯。此外，也有人报告说，四氯化碳是能够氧化1型的H-磷酸单酯，因为该单烷基磷酸酯二价阴离子，可以产生（回流的纯乙胺）。因此，缺乏H-硫代磷酸酯2a与该氧化剂的反应，并且2a与所有软卤素供体（碘，的溴，四溴化
碳和四碘化碳）的快速氧化反应，表明含硫卤素的相互作用可能是反应进行中至关重要的。
一些观察到的H-硫代磷酸单酯2a PH键的酸度，在纯重水中的一个简单的质子-氘交换实验，由三乙胺催化进行（方案5）。溶解在重水里的2a的端部和三乙胺（3当量）和质子-氘交换过程在31P NMR谱之后。据预计，在纯重水里，2a的每次电离形成二价阴离子5a，都将会导致氘的掺入。因为经历1小时后仅约起始材料2a的50％成为氘，这意味着它们产生的硫代磷酸酯二价阴离子5a是相对较慢的。考虑到在四氢呋喃中H-硫代磷酸酯2a与碘的氧化需要几秒钟，这几乎是不可能经由路径A（方案2）进行的，如亚磷酸二价阴离子5的中间体。
用H-硫代磷酸酯，H-二硫代磷酸酯，和H-硫代硒酸单酯氧化磷酸化的制备草案的发展。在确定了调查反应的机理基础上，我们希望确定真实的，制备硫代，二硫代和硫代硒酸化的目的范围和限制。正如上一节中所示，可以从乙酯H-硫代磷酸酯2a中（10a-10d;图2）或从经碘氧化的硫代磷酸化的核苷H-硫代磷酸酯2b中（11A，11B，11D;图表2）得到许多磷酸二酯。此外，核苷H-二硫代磷酸酯（3a）和H-硫代硒酸酯（图4a）被成功地用于乙醇的氧化磷酸化，产生相应的二硫代磷酸酯（18）和硫代硒酸二酯（19）（方案4）。
由于对可以作为生物化学和药物化学工具的带有的单个或多个修饰的磷中心（例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯硒代磷酸酯等）的核苷酸类似物的兴趣与日俱增，我们决定集中精力优化反应条件，经由氧化磷酸制备的核苷类似物。核苷H-硫代磷酸单酯2，H-而硫代磷酸酯3，和H-硒代磷酸酯4（图1）可以作为氧化磷酸化底物，吸引人的特点是这些化合物容易获得，并且和H-磷酸二酯衍生物相比，可以使未受保护的硫代磷酸，二硫代磷酸和硫代硒酸酯基团转移到羟基化合物上（见上文）。
首先，使用核苷H-硫代磷酸单酯2b作为模型化合物，对不同的溶剂进行筛选，使其可以作为所研究的氧化磷酸化有效的反应介质。为了这个目的，在甲醇（10当量）和三乙胺（3当量）存在的条件下，在四氢呋喃，二恶烷，乙腈，吡啶，甲苯和二氯甲烷的存在下作为溶剂时，让H-硫代磷酸酯 2b与碘（1.1当量）反应。结果发现，在四氢呋喃，二恶烷，乙腈，吡啶的实例中，一个纯净的，迅速形成磷酸二酯11a的反应（图2）发生（31P NMR分析）。相对于这些，当反应进行在甲苯或二氯甲烷中，该反应混合物的31P NMR光谱显示了大量的不同强度的信号（约在20左右），表明所生成的硫代磷酸酯和/或它与反应的胸腺嘧啶核苷碱基的聚合。在此基础上，我们初步得出结论，有效溶剂在其中偏磷酸酯中间体参与的氧化磷酸化必须具有路易斯碱性质（例如，四氢呋喃，二恶烷，乙腈，吡啶）。这些溶剂在反应过程中显然不是被动的，但在偏硫代磷酸酯中间体的合成过程中起到重要的稳定作用，形成相应的加合物（例如，12，13，14;图3）。如果这样的稳定性是不可能的，这可能是溶剂缺乏孤电子对（例如，甲苯，二氯甲烷）的情况下，在“发现”亲核试剂之前，非常自由活泼的偏硫代磷酸酯发生聚合。
到目前为止，对所有的氧化磷酸化的实验都在10当量或无水醇的存在下进行的，我们研究是否有可能降低反应中过量的醇的量。我们发现，以四氢呋喃作为溶剂，当3当量的1°醇（甲醇和乙醇），5当量的2°醇（异丙醇），或10当量的3°醇（叔丁醇）用于该反应时，核苷H-硫代磷酸酯2b可以有效地进行耦合，以产生纯的相应的硫代磷酸二酯（11a-d）。如果一个给定的醇的量较低，
它导致偏硫代磷酸酯的部分聚合和副产物的形成。在制备规模采用这种方法可以分离得到纯的11a-d，收率85-93％。
作为这些合成研究的最后阶段，我们试图使用这种新开发的方法，改性的3'-5'核苷酸键的化合物的制备，即，经3'-O - TBDMS胸苷（20）氧化磷酸化（方案6）,二核苷硫代磷酸酯（11e），二核苷二硫代磷酸酯（21），和二核苷硫代硒酸酯（22）的制备。
出人意料的是，当我们加入碘（1.1当量），到含核苷H-硫代磷酸酯2b，3'位保护的胸苷衍生物20（3当量），和三乙胺（3当量）的四氢呋喃溶液中，不形成预期二核苷硫代磷酸酯11e（TLC和31P NMR分析）。而是，熟悉的信号标志，源自产生的偏硫代磷酸酯中间体的聚合，可以在反应混合物的31P NMR谱中观察到。增加过量核苷20的最多10当量将没有改进。
一种可能的说明为什么这种反应会失败的解释：是核苷20，有效的亲核性太低而不能确保在短期存在的偏硫代磷酸酯中间体进行有效的攻击，即使该中间体被四氢呋喃部分地稳定。核苷分子的大体积意味着低扩散系数（缓慢扩散）和长相关时间（慢旋转），其与空间位阻一起可以降低20捕捉偏硫代磷酸酯中间体的能力。
为了解决这个问题，我们试图通过在吡啶中进行反应，形成更稳定的加合物（图3,14），以增加偏硫代磷酸酯加合物的寿命。在这样的反应条件下，二核苷硫代磷酸酯11e确实形成了，但是不幸的是，该反应很缓慢（约3小时），并导致了副产物的显著生成。在四氢呋喃中，使用DABCO作为反应介质（中间类型15;图3）对反应的结果没有改善。这些实验表明，经偏磷酸酯类的中间体的反应过程需要微调形成的偏磷酸酯加和物反应性以达到令人满意的效果。因为类型14和15的偏磷酸酯加合物显然对核苷20没有足够发反应性，我们再次研究物质12的四氢呋喃加合物，但其反应性降低，这个时候我们进行20在-78℃的条件下进行氧化硫代磷酸化。这是有益的发现，在这样的反应条件下二核苷硫代磷酸酯11e迅速形成（大约30秒），但需要反应进行完全，它与修饰的核苷20反应过程中，必须使用10当量的核苷20.相同的方法用到核苷H-而硫代磷酸单酯3a和核苷的H-硫代硒酸酯4a中，纯二核苷二硫代磷酸酯21和二核苷硫代硒酸酯22，分别有良好的分离效率。
结论和展望
8-氮杂-7-脱氮-7-辛-1,7-二炔基-2′ - 脱氧鸟苷（2d）的合成是8-氮杂-7-脱氮-7-碘-2′ - 脱氧鸟（图2b）和过量辛二炔通过Sonogashira交叉偶联反应进行。核苷2d中被转化成亚磷单元和制备寡核苷酸。由7- 辛二炔基核苷2d替换的dG残基增加dG-dC碱基对稳定性，8-氮杂-7-脱氮-7-丙炔基-2′- 脱氧鸟苷（2c）和7-脱氮-7--辛-1,7- 二炔基-2′- 脱氧鸟苷（1）以类似的方式进行。带有局部刚性连接臂和末端三键辛-1,7- 二炔吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物2d，在核苷和寡核苷酸的各个阶段进一步由所述的叠氮化物 - 炔胡伊斯根-麦尔德尔-夏普勒斯环加成官能（'点击'反应）进行功能化反应。
带有非荧光性3-叠氮基-7-羟基香豆素15的终端三键的缀合导致的高荧光染料偶联物的形成。8-氮杂-7-脱氮-2′- 脱氧鸟苷共轭16的荧光强度被发现比相应的7-脱氮2′- 脱氧鸟苷共轭化合物17强十倍。被吡咯并[2，3-d]嘧啶诱导的荧光熄灭消失在吡唑并[3,4-d]嘧啶偶联物的情况中。根据我们的数据和他人的实验结果，从吡咯并[2,3-d]嘧啶核碱基到染料，电子转移没有发生在吡唑并
[3,4-D]嘧啶的情况下。图8显示一个核苷染料共轭复合物（A，B）分子间的联系和两个核苷染料结合物之间的分子间可能的分子内联系。
8-氮杂-7-脱氮-2′- 脱氧鸟苷和7-脱氮-2′ - 脱氧鸟苷是2′- 脱氧鸟苷 在7位上官能化并且不干扰DNA螺旋结构的最理想的形状模仿 。他们的结合物香豆素（16和17）显示几乎相同的碱基配对性质，但有着强烈的荧光强度差异。核碱基特定荧光熄灭的差异有可能应用于DNA和RNA的检测或测序。



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