生化大实验实验报告

生化大实验

实验报告

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指导老师：

实验1 多酚氧化酶（PPO）的分离提取

一、实验原理：

多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。

植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外，多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。

蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。

二、实验目的：

通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。

三、材料与试剂：

1.材料：马铃薯（两小组共称200g）

2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的浓缩液1000ml； 固体硫酸铵； 0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）

3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机；

四、操作步骤：

1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min；

2.用两层纱布将所得的浆液过滤；

3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min；

4.上清液两组平分，每组150ml，加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min；

5.取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min；

6.将所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。

五、结果和分析：

实验所得的初酶液颜色为浅黄色，颜色浅，主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少，从而最大程度的保留了PPO的活性；经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体，这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。

六、讨论与结论：

1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化；

2．实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净；

3.加入硫酸铵固体时一定要小心缓慢，同时伴有玻璃般的搅拌，在溶解蛋白的过程中避免溶液局部盐离子浓度过大，使蛋白变性，并注意用量的计算，第二步加入的时候起点浓度是40%而不是0，否则会加入过量，影响实验的结果；

4.透析时，提前检查透析袋是否完整，避免透析时出现孔洞导致样品丢失。

实验2 胰酶分离提取及活性诱导

一、实验原理：

胰酶是医药、食品、饲料等工业上重要的酶制剂，胰酶的分离提取是普通生化实验的最主要、最经典的实验。

提取胰酶的经典方法，多采用硫酸铵分级沉淀，胰酶在75%饱和硫酸铵中沉淀，其它杂蛋白一般在10%硫酸铵饱和度下被沉淀除去。经此多次提取，最后在pH 8.0硼酸缓冲液中得到结晶。

胰酶在pH 3.0时最为稳定，可在低温下储存较长时间而不失活；低于此pH酶易变性；高于pH 5.0时，酶易自溶而失活。因此提取制备胰酶的全部操作过程易在低pH和低温下进行。胰酶以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。

二、实验目的：

本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备样品。

三、材料与试剂：

1.仪器：紫外光分光光度计、恒温水浴、离心机、组织捣碎机、pH计、显微镜、秒表、剪刀、镊子、搪瓷盘、乳钵，大玻璃漏斗、抽滤瓶，塑料小桶、纱布、pH试纸，滤纸、玻璃器皿等；

2. 材料：新鲜猪胰脏；

3. 试剂及溶液配制：pH 2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M NaOH溶液、5M NaOH溶液、0.1M HCl溶液、0.025M HC1溶液、0.01M HCl溶液、0.4M pH 9.0硼酸缓冲液Tris，硫酸铵，0.8M pH 9.0硼酸缓冲液。

四、操作步骤：

1.取新鲜猪胰脏1个冰浴下剥除脂肪和结缔组织，用绞肉机绞碎胰脏；

2.加1-2倍体积已预冷却的pH 2.5-3.0乙酸酸化水溶液提取(按1g组织相当于1ml体积算)；

3.检查提取液中pH，若高于pH 3.0时应及时用10%乙酸调节，使提取液维持在pH 2.5-3.0之间，在冷室5℃左右搅拌提取18-24h，4层纱布过滤，用50m1 pH 2.5乙酸酸化水抽提残渣一次(时间约为1-2h)合并滤液，用5M H2PO4溶液调正pH至2.5-3.0，过滤，离心30min，取上清，量其总体积；

4.盐析加固体粉状硫酸铵33.9g，至40%饱和度；盐析1h，12000rpm离心10min；

5. 然后上清液加硫酸铵33.3 g，至75%饱和度盐析1h，然后12000rpm离心10min；

6. 沉淀溶于10ml pH 7.5，0.1M Tris，透析过夜，4℃保存。

五、结果和讨论：

1. 经过以上实验步骤得到澄清的酶液。

2. 用新鲜的猪胰脏是因为新鲜的胰脏胰酶含量高，容易分离提取。

3. 提取过程中保持pH值2.5-3.0之间，是因为胰酶在低pH值下没有活性，不会催化其他蛋白的水解从而降低酶的含量。

4. 加入硫酸铵固体时一定要小心缓慢，同时伴有玻璃棒的搅拌，在溶解蛋白的过程中避免溶液局部盐离子浓度过大，使蛋白沉淀变性，并注意用量的计算。

实验3 卵清蛋白的分离提取

一、实验原理：

鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子比为1：1。鸡卵粘蛋白是糖蛋白，分子量28000，但糖成分上有差别。有四种不同组分，等电点的围为pH 3.9-4.5，280nm的消光系数为A=4.13(1%，1cm)。鸡卵粘蛋白在中性或是酸性溶液中和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中较不稳定。

由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶的强烈抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白做亲和配基制备纯化胰酶的亲和柱材。

二、实验目的：

掌握鸡卵清蛋白的提取方法和操作步骤，为以后进行自己的实验打下良好的基础。

三、材料与试剂：

1.材料：新鲜鸡蛋2只；

2.仪器：抽滤瓶500-1000ml、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器；

3.试剂：10%TCA，5N HCl，5N NaOH，冷丙酮，胰蛋白酶液，BAEE-0.05M，pH 8.0 Tris-HCl缓冲液，pH 8.0 Tris-HCl缓冲液。

四、操作步骤：

1.取两只新鲜鸡蛋，得蛋清50ml，置于烧杯中，外用温水浴25-30℃，在不断搅拌条件下，缓慢加入等体积的三氯乙酸-丙酮（1：2V/V），立即出现大量白色絮状沉淀，加完后最终pH约3.5，在继续搅拌30min，然后在4℃放置过夜；

2.次日进行离心，得黄绿色清液；

3.边搅拌边加入4℃遇冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在4℃放置2h之后将上清也小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于10000rpm离心5min，收集沉淀；

4. 将沉淀溶于10ml无离子水中，对无离子水透析4h，换水两次，在对碳酸钠缓冲溶液透析过夜，10000rpm离心10min，去除不溶物，取少量上清液；

5. 10000 rpm离心10 min，取上清液。

五、结果和分析：

1.经过上面实验得到了较为纯净的鸡卵粘蛋白，呈白色粉末状。

2. 在离心以后一定要弄清楚是收集沉淀还是上清液，否则实验将会失败。

3. 在实验中要控制pH值，不能使其成碱性，否则粘蛋白会分解，影响粘蛋白的量。

实验4 柱层析纯化PPO

一、实验原理：

柱层析技术是常用的纯化酶、蛋白的手段。在普通生化操作中经常通过离子交换层析和凝胶层析联用实现蛋白质的纯化。

(1)PPO的基团能被离子交换树脂所吸附从而可以把PPO从溶液中分离出来去掉杂蛋白。在用与树脂离子结合强度比PPO大的洗脱液洗脱就可以得到较为纯净的PPO蛋白。

二、实验目的：

1.通过离子交换层析和凝胶色谱层析分离纯化PPO的操作，以期掌握柱层析的基本原理、运用及操作技术，并了解凝胶色谱测定蛋白质分子量的基本原理和操作方法。

三、材料与试剂：

1.材料：实验一所得的PPO粗提液。

2. 试剂：0.02M Tris-HCI缓冲液pH 7.4（含0.001M EDTA）配制时配X10倍浓缩液1000m1； NaCl；聚乙二醇。

3.实验器械与仪器设备：

试管架、烧杯、玻璃棒、移液管、滴管等、试剂瓶、层析柱PH计和pH试纸恒流泵、梯度混合仪。

四、操作步骤：

1. DEAE-纤维素的处理及装柱，按照树脂材料的要求对进行处理，将处理好的材料装入洗净的层析柱，柱材装到离柱上端1.5-2cm时停止。

2. 平衡：柱材装好后柱上端进液口接恒流泵，下端出液口连接蛋白检测仪，用0.02M Tris-HCl缓冲液对柱材进行平衡，直到仪器的显示数据不再变化为止。

3. 上样：将粗提酶液上柱，用0.02M Tris-HCl缓冲液pH 7.4洗脱蛋白。

4. 洗脱：用含NaCl的0.02M Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，同时用小试管接洗液，每管接到试管的2/3处。共接收8管。

五、结果和分析：

1.经过柱层析纯化的PPO用1.5ml的离心管收集，每管收集2/3体积。收集液无色。

2.在上样之前一定要平衡好柱子，否则首先洗脱下来的是缓冲液，影响洗脱效率。

3,柱子要竖直，以免柱材料表面不水平，从而影响洗脱

实验5：酶含量和活性测定

一、 实验原理：

(1)蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合后会显示不同的颜色，测定其合适波长下的OD值可以推算出蛋白的含量。

(2)PPO可将酚类物质氧化成有色物质，通过测一定波长的OD值便可以推算出PPO的含量。

二、实验目的：

掌握酶蛋白含量和活性测定的方法。

三、材料与试剂：

1.材料：

经硫酸铵沉淀获得PPO粗酶液，DEAE-纤维素DE52分离的酶液和Sephadex G-200分离纯化的酶液样品。

2.仪器与器皿：

分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管和试管、核酸蛋白检测仪； GL-20C高速冷冻离心机，酶标板，酶标仪等。

3.试剂：

考马斯亮蓝G-250蛋白试剂、蛋白标准液；DEAE-纤维素DE52；葡聚糖凝胶Sephadex G-200；兰葡聚糖、葡聚糖-40、 70、100等。硫酸铵沉淀组分，DE-52洗脱组分，邻苯二酚，0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液pH 5.8，考马氏亮蓝G-250蛋白试剂，蛋白标准液。

四、操作步骤：

测定酶活性和蛋白浓度，计算纯化倍数。

（1）酶含量测定

依次分别取洗脱下来的8管试液20μl加入到酶标板的2-9孔，第一孔加入20μl洗脱液，第10、11孔加入20μl粗酶及粗酶1。在在所有孔中加入100μl考马氏亮蓝G-250蛋白试剂显色10min，然后用酶标仪测OD值。

（2）酶活性的测定

依次分别取洗脱下来的8管试液20μl加入到酶标板的2-9孔，第一孔加入20μl洗脱液，第10、11孔加入20μl粗酶及粗酶1。再在所有孔中20μl柠檬酸缓冲液，然后加入20μl邻苯二酚试剂显色10min，然后用酶标仪测OD值。

五、结果和分析

1. 凝胶色谱层析纯化PPO：蛋白的含量、酶活、纯化倍数的测定结果

不同试管中蛋白的显色后的OD值：

从OD值的大小，可以得知粗酶的蛋白含量是最高的，粗酶1初步纯化，其他几个不同时间段所接收的洗液第4号试管收集最集中，蛋白含量最高。从OD值的大小来看，第4管酶活性最大，粗酶酶活大幅提升，最后纯化的第4管就是PPO最集中的一管，且酶活最高。

2. 离子交换层析纯化PPO：蛋白的含量、酶活、纯化倍数的测定结果

从上述结果看一看出，用离子交换层析纯化PPO,PPO的含量和酶活都没有什么太大的变化，并且比起用凝胶色谱层析纯化的酶含量和活性都要明显降低，但是纯化倍数却比较高，因此实验总体来看不是很成功，可能是操作没有严格执行。

六、结论与讨论

1. 从上面结果可知，粗酶提纯的过程是杂蛋白减少，酶活力提高的过程。

2. 从上面实验数据可知，柱层析的纯化效果一般。

3. 上样时要控制好速度，不可使胶干了，反应时加入酶标板后要充分混合。

4. 上样前一定要先平衡层析柱，保证样品在层析柱时所处的pH及离子强度环境一致减少样品的分解变性，上样之后就要立即接收洗液。

5. 测定酶活时加入底物后要静置一段时间让底物充分反应后再测，这样测出来的结果才比较准确。

实验6 亲和层析纯化胰酶及酶含量和活性测定

一、实验原理：

(1)利用生物分子和相对应分子之间亲和结合和解离性质而建立起来的层析方法称之为亲和层析。亲和层析的原理就是酶和抑制剂可以发生特定的专一性的结合，利用这一特性可以将酶和其它蛋白质分离开来。

(2)酶蛋白和考马斯亮蓝G-250结合后会显示不同的颜色，测定其适合波长条件下OD值可以推算出酶蛋白的含量。

(3)胰酶可以水解BAEE生成N-苯甲酰-L精氨酸这种在253nm下有最大吸收峰的有色物质，可以根据所测BAEE被胰酶水解后的OD值变化来推算胰酶的活力。

二、实验目的：

通过将胰蛋白酶和抑制剂-鸡卵粘蛋白与sephadex-G75偶联及亲和层析纯化胰酶的操作，来了解亲和层析的基本原理，掌握亲和柱层析和柱材活化偶联及亲和层析操作的基本过程和技术。再通过胰酶的含量及活性测定加深对酶含量及活力测定的一般方法和步骤。

三、材料与试剂：

1.材料：鸡卵粘蛋白，胰蛋白酶液。

2.试剂：Sephade-G75，0.11M Tris-HCl pH 7.5，0.1N甲酸钾-0.5M KCl pH 2.5，考马氏亮蓝G-250，BAEE。

3.仪器：抽滤瓶，层析柱，蛋白检测仪，烧结漏斗，移液器，磁力搅拌器，酶标仪，酶标板。

四、操作步骤：

1.Sephadex-G75的活化及偶联：

（1）2.5g干重的葡聚糖凝胶Sephadex G-75，溶胀洗涤数次；

（2）加入0.05M NalO4溶液50ml，30min；

（3）蒸馏水洗涤数次，抽干备用；

（4）纯化的鸡卵粘蛋白35ml，加入活化葡聚糖凝胶；

（5）5%K2CO3调pH 7.5-9.0，缓慢搅拌3h，反应过程随时加入5% K2CO3；以保持pH稳定；

（6）0.27g KBH4溶于20ml水，缓慢搅拌加入上述体系反应5h，pH维持在6.5-7.5洗涤；

2.胰蛋白酶的亲和层析：

（1）装柱，按照树脂材料的要求进行处理，将处理好的材料装入洗净的层析柱，柱材装到离柱上端1.5-2cm时停止；

（2）平衡：柱材装好后柱上端进液口接恒流泵，下端出液口连接蛋白检测仪，用0.5M KCl 0.05M CaCl2缓冲液对柱材进行平衡，直到仪器的显示数据不再变化为止；

（3）上样：将胰蛋白酶液上柱，待蛋白检测仪在280nm处达到峰值后停止上样；

（4）洗脱：用含pH7.5 的缓冲液进行洗脱，待蛋白检测仪记录的吸收值回到基线时，改用0.1M的甲酸钾0.5M KCl pH 2.5的洗脱液进行解吸附，收集洗脱下来的蛋白共9小试管，每管接到试管的2/3处；

3. 测定酶活性和蛋白浓度：

（1）酶含量测定：

依次分别取洗脱下来的9管试液200μl加入到酶标板的2-10孔，第1孔加入200μl洗脱液，第11孔加入200μl粗提液。在在所有孔中加入20μl考马氏亮蓝G-250蛋白试剂显色10min，然后用酶标仪测OD值。

（2）酶活性的测定：

依次取洗脱的9管试液200μl加入到酶标板的2-10孔，第1孔加入200μl洗脱液，第11孔加入200μl粗提液。再在所有孔中加入20μl BAEE，显色10min，然后用酶标仪测OD值。

五、结果与分析：

1.蛋白含量的测定结果

不同试管中蛋白的显色后的OD值：

从上面表格结果及下图可以得知，酶蛋白含量的变化趋势是先高后低，而第10管的酶蛋白含量是最高的；粗酶的含量的OD值是0.133，明显比第10管低，可见亲和层析对酶有浓缩作用。

六、结论与讨论：

1.从以上数据及图表看，纯化的效果较好。这可能是因为洗脱的时间够长，洗脱液的离子浓度够大，能将蛋白质洗脱下来。

2.在上样品时可以多上一些，若柱子装不下，可以将下端出液口打开，放出部分液体，待到检测仪的读数有大的变化时收集洗液。

3.层析柱一定要平衡好后才能使用，否则实验结果会很不准确。

4.检测仪使用前一定要调零，还要使用正确的档位。

5.测OD值时每个子实验的所有数据都要在同一参比下一次性完成，这样的结果才会准确。

实验7 SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质纯度鉴定

一、实验原理：

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它的电荷量及分子量大小和形状等因素。在聚丙烯酰胺凝胶中加入SDS后能使蛋白质带恒定量的负电荷，从而它的移动速度仅取决于分子量的大小，而与所带电荷无关。

二、实验目的：

通过实验，学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白纯度和分子量的方法。

三、材料与试剂：

1.材料：胰酶粗提液；

2.试剂与仪器：丙烯酰胺母液；SDS溶液，过硫酸铵溶液，TEMED，电极缓冲液，样品缓冲液，染色液，脱色液，标准分子量蛋白，电泳仪，垂直电泳槽。

四、操作步骤：

1.凝胶制备：用两块电泳玻璃板制成垂直板槽，垂直放置。将配制好的分离胶溶液倒入，滴加无离子水，待胶凝聚后，倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，再插入梳子。

2.上样：分别取样品若干于离心管中，按1/1-1/5比例加入5倍样品缓冲液，在沸水浴中加热3-5min，取出待用。用微量注射器分别吸取不超过30μl不同浓度的标准蛋白样品和实验样品注入样品槽。点样结束后，调节电泳仪电流稳定不变，当溴酚蓝迁移到离分离胶底1-2cm时即可停止电泳。

3.染色：电泳完毕后，取出凝胶板，浸入染色液中，在37℃温箱中保温过夜。倒掉染色液，用脱色液脱色，第二天换一次脱色液，24h后，即可看到清晰的条带。

五、结果与分析：

脱色后的凝胶块拍照所得照片如图所示：

六、结论与讨论：

1. 上图中为各组的PPO蛋白和胰酶蛋白；

2.照片中明显的条带几乎集中在同一水平线上，可见实验的效果还是比较好的。

3.制胶时应注意不要留有气泡，影响实验的精确性。

4.加入无离子水时应该在胶的一侧加入，不宜从一边到另一边缓慢加入，保证胶面的平整。

5.根据分子量大小，推算出目标蛋白的位置，Marker条带可以很方便确定每条条带的分子量，从而对应找出目标蛋白的分子量。

实验8 Western-blotting

一、实验原理：

Western blotting技术是用来检测蛋白质的特定的、灵敏的方法。主要由蛋白质的SDS-PAGE、电转及杂交几部分组成。Western印迹法检测蛋白的敏感性约为1-5ng，0.75mm厚的SDS-PAGE板的一个孔可以上总蛋白量为100μg，所以只要被检测蛋白不低于总蛋白量的万分之一，即可被检测出来。如果所分析的样品为未知时，应同时作阳性对照。

杂交技术主要有NC模的封闭，靶蛋白与第一抗体的反应，结合靶蛋白的一抗与二抗的反应，显色等几部分构成。该技术的原理及过程主要为转移到NC膜上的蛋白带结合膜的可结合位点，用其他蛋白作为封闭液将其他未结合位点封闭，靶蛋白与第一抗体反应，将其他蛋白从膜上洗脱出去，结合靶蛋白的一抗与二抗反应洗脱，而后显色检测蛋白的存在。

二、实验目的：

学习和掌握western-blotting的一般方法和步骤。

三、材料与试剂：

1.材料：待检测的胰蛋白；

2.仪器：电转移槽，电泳仪，塑料封口机，摇床；

3.试剂：转移缓冲液：电极缓冲液加20%甲醇；

封闭液：1%(W/V)脱脂奶粉，溶于TBST中；

TBST：150mM NaCl，

50mM Tris-HCl (pH 7.5)

0.01% antiform A，0.02%叠氮钠

第二抗体稀释液：

1%(W/V)脱脂奶粉，溶于TBST中

0.5% Tween 20

碱性磷酸酶酶显色液

四、操作步骤：

1.SDS—PAGE电泳见实验11；

2.电转：

(1)剪6块3mm滤纸和一块NC膜；

(2)将剪好的滤纸和NC膜在转移缓冲液中浸泡3-5min；

(3)按下列过程安装转移装置，将塑料支架平放在含转移液的托盘中，在塑料支架上放一块海绵；

(4)将三块3mm的滤纸对齐放在海绵上，然后依次将NC膜、凝胶及另3块滤纸和海绵放上；

(5)用塑料支架夹尽上述各层，放入电转移槽，NC膜一侧向正极，凝胶一面向负极；

(6)接通电源电压40V，电流0.17-0.2A，转移1.5-6小时；

(7)转移结束后，取出塑料架，依次揭掉各层，用铅笔在膜上沿作好记号，切下其中一个孔所对应的膜的一半，用氨基黑或考马氏亮兰染色，检查效果；

(8)将其他的膜放在一干净的3mm的滤纸上，室温干燥30-60min；

(9)NC膜的封闭，将经过电转移并干燥的NC膜放于一平皿中，加入封闭液室温下轻轻荡漾2-3h；

(10)将第一抗体用封闭液稀释，稀释度由预实验确定；

(11)将B中封闭好的NC膜放入塑料袋中，加入一抗，加入量为0.1ml/cm2 NC膜，赶走气泡，封口机封口，4度下轻轻震荡2h；

(12)洗膜，反应结束打开塑料袋弃掉废液，用PBS洗三次每次10min；

(13)将二抗稀释，稀释度为1：200-1：2000。将NC膜放入塑料袋中，加入二抗，加入量为0.1ml/cm2 NC膜，赶走气泡，封口机封口，室温下轻轻震荡1h；

(14)剪开塑料袋取出NC膜，在150mM NaCl，50mM Tris-HCl 中洗脱1-5次，每次10min；

(15)将膜放入显色液中，室温下轻轻摇动；

(16)将条带出现后，立刻用水洗膜。然后用TE终止；

五、结果与讨论：

电转图

1.经过以上的实验操作，NC膜经过显色出现的条带可以看见，做的效果还可以。

2.在加入一抗前一定要先封闭，不然一抗会结合膜的结合位点，造成假阳性。

3.加入二抗前一定要洗脱彻底，否则会造成假阳性。

4.如果显色结果不太明显，原因可能是在转膜的时候未能将蛋白大量的转移到膜上，也可能是抗体的量太少，结合的量有限，显色后不是很明显，还有可能是显色剂的量太少或是显色条件不适合。

实验9 染色体DNA的提取

一、实验原理：

DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。本实验通过裂解液裂解细胞(植物样品由液氮下研磨以粉碎组织)，有机溶剂反复抽提，使DNA进入水相与蛋白成分分开，在RNase作用下，降解RNA以提纯DNA。

二、实验目的：

通过实验学习和掌握提取植物染色体DNA的原理和方法。

三、材料与试剂：

1.材料：培养菌体；

2.仪器：超净工作台、培养箱、摇床、高速冷冻离心机、超级恒温器或恒温水浴、台式离心机、取液器一套、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、电泳仪、水平电泳槽、紫外观测仪；

3.试剂：细胞裂解液(100mM Tris-HCl，5mM EDTA，500mM NaCl，1.25% SDS，pH 7.5)，

饱和酚，氯仿/异戊醇，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70％无水乙醇，3M NaAC，RNase，50×TAE缓冲液，电泳载样缓冲液。

四、操作步骤：

培养菌体

10ml裂解液，1/10体积酚

65℃，20-30min，加等体积的氯仿，轻摇

离心(12000-15000rpm)，15min

上清液

加等体积的氯仿，轻摇，离心(12000-15000rpm)，15min

取上清(如界面不清，则在此之后可用氯仿反复抽提多次)

加0.6体积冷异丙醇(-20℃)或2体积冷无水乙醇(-20℃)

0.1体积3M乙酸钠(pH 5.2)

室温10min，离心(12000-15000rpm)，10min

沉淀

70%乙醇洗一次，无水乙醇，离心(12000-15000rpm)，10min

真空干燥

复溶于2ml TE(或水)

加RNase摇匀，65℃或37℃,10-30min

等体积酚，酚/氯仿，氯仿各一次，离心(参数同上)

取上清

加异丙醇或无水乙醇，3M乙酸钠(pH 5.2)，离心(参数同上)

沉淀

70%乙醇洗涤(方法同上)

沉淀真空干燥，

复溶于0.5-1.0ml的TE或水中，分装成小体积，4℃或-20℃保存。

五、结果与分析：

实验结果如上图所示，条带弥散，可能是模板降解，没有条带可能是点样没点上等实验操作不过关造成的，在今后实验中应尽量避免。

实验10 质粒DNA的提取与纯化

一、实验原理：

细菌质粒多为一些双链环状的DNA分子，其大小围从1Kb-200以上Kb不等，它是独立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助性遗传单位，而且它还是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时的最主要的DNA载体。质粒DNA的提取根据目的的不同，可以有不同的方法，但基本步骤多为三步：第一，细菌培养和质粒的扩增；第二，细菌菌体的裂解；第三，质粒DNA的纯化。菌体裂解的方法主要有沸煮法，SDS法，碱解法，Triton-溶菌酶法等。质粒DNA纯化的方法主要有梯度离心法、柱层析法等。

二、实验目的：

掌握碱变性抽提质粒DNA法的一般步骤和操作方法，熟悉质粒DNA的纯化方法和步骤。

三、材料与试剂：

1.材料：大肠杆菌；

2.试剂：

Solution I：50mM 葡萄糖

25mM Tris-HCl (pH 8.0)

10mM EDTA (pH 8.0)

高压灭菌，4℃保存

Solution II：0.2M NaOH，1% SDS，现配现用；

Solution III：5M KAC，60ml，11.5冰乙酸，28.5水，4℃保存；

3M NaAC；pH 5.2 高压灭菌；4℃保存；氨苄青霉素；50mg/ml；溶菌酶；

酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)；异丙醇； LB培养基；TE缓冲液；电泳试剂；

四、操作步骤：

2ml/20ml 培养菌体 37℃ 200rpm 过夜

离心，4℃，5000rpm，10min

沉淀(菌体细胞)

加入预冷的100μl Solution I

加入200μl SolutionII，冰浴中5min

取上清

2V乙醇，0.3V 3M NaAC，-20℃，30min

离心(12000g)，10min

取沉淀→冻干干燥→再悬浮于50μl TE缓冲液

五、结果与分析：

通过以上的步骤得到了较为纯净的质粒DNA，为后续的实验准备了材料。

提取质粒DNA的电泳结果如上图所示，最下面最亮的一条条带为超螺旋质粒DNA，结果表明，质粒DNA的提取较纯。从点样孔到主带间没有明显背景，说明蛋白质去除较干净。

六、结论与讨论：

1. 通过以上的步骤得到了较为纯净的质粒DNA，为后续的实验准备了材料。

2. 试剂中所用葡萄糖有增加粘度，降低剪切率，减少DNA的降解。

3. 试剂中所用EDTA有抑制DNase的作用，还能降低离子浓度，而高浓度离子对溶菌酶有抑制作用。

4. 试剂中所用NaOH能使DNA变性，KAC能使DNA复性，并有助于蛋白等其它大分子成分沉淀。不用酚/氯仿抽提；B，LB培养基残留；C，提取中在溶液II中时间过长，导致共价闭合环状DNA不可逆变性，则可能影响酶切培养菌。

实验11 酶切技术

一、实验原理：

限制性切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，这类酶的发现和应用促进了以DNA重组为基础的生物工程技术的迅猛发展。该类酶是体外剪切基因片段的重要工具。

二、实验目的：

本实验主要通过EcoR I，Hind III两种限制性切酶对λDNA，质粒DNA和染色体DNA的单酶切或双酶切的操作来学习和掌握亚克隆这项技术。

三、材料与试剂：

1.材料：λDNA；

2.试剂与设备：EcoR I及缓冲液，Hind III及缓冲液，λDNA 0.532μg/μl，TAE缓冲液，离心机，恒温水浴，取液器，电泳仪，电泳槽，紫外观测仪。

四、操作步骤：

1.EcoR I 、Hind III单酶切、部分酶切及双酶切：

取2支干净、灭菌新Eppendof管，分别按下表加入以下试剂：

37℃保温1-2小时，保温结束后，加入0.5M（pH 7.2）EDTA（使终浓度达到10Mm）。加入6μl电泳加样缓冲液电泳。

五、结果与分析：

下图为实验的电泳条带图。

六、结论与讨论：

1. λDNA、质粒DNA、染色体DNA 的EcoR I和 Hind III双酶切的条带有的出来了，有的没出来，这可能是因为实验操作不过关造成的。

2.出来的条带，酶切效果还不错。

实验12 DNA片段的连接技术

一、实验原理：

DNA酶切片段的连接是两DNA片段相邻的5′-磷酸和3′-羟基间可由连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶催化，但是在分子生物学实验中主要采用T4 DNA连接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。

二、实验目的：

本实验拟通过T4连接酶对酶切片段的连接操作，使学员掌握这一DNA片段的连接技术。

三、材料与试剂：

1.试剂： 0x T4 DNA连接酶缓冲液，λDNA，酚/氯仿，酚，TE缓冲液，电泳缓冲液，3M NaAc；

2.仪器：离心机，恒温设备，真空干燥机，取液器。

四、操作步骤：

取干净灭菌的离心管，按下表加入试剂：

19-20℃保温2h，提取已连接好的DNA片段，电泳分析。

五、结果与讨论：

因为基因的量相对较少，所用的载体的量较大从而可以保证足够的碰撞机会以保证实验λDNA片段连接成功。

实验13 受体菌感受态细胞的制备

一、实验原理：

当细菌处于容易吸收外源DNA的状态时，即为感受态，而用理化手段使细菌处于感受态的操作为致敏过程。感受态细胞的制备是重组基因能否实现转化的一重要的技术环节。

二、实验目的：

本实验拟通过这方面的操作，使学员了解和学习感受态细胞的制备过程。

三、材料与试剂：

1.试剂：LB培养基，0.1N CaCl2，0.1M MgCl2，3mM 氯化6氨合高钴，

TFB ：10mM MES (pH 6.3)

45mM MnCl2

10mM CaCl2

100mM KCl

2. 材料：大肠杆菌。

3. 仪器：离心机，恒温摇床，恒温水浴，超净工作台，冰柜。

四、操作步骤：

1.大肠杆菌在LB平板上划线培养12-16h，挑取单菌落于LB培养基中摇瓶培养大肠杆菌到对数期。

2.取1ml培养物7000rpm离心3min收集菌体，冰浴放置。

3.用预冷的氯化镁悬浮菌体，7000rpm离心3min，收集菌体，冰浴放置。

4.加入200μl预冷氯化钙，放置于冰浴，即得感受态细胞，此细胞可现用，也可以进行下步操作。

5.将悬液分装于无菌离心管中，投入液氮，然后储存于-70℃。

五、结果与讨论：

1.经过以上的实验步骤得到了一定量的感受态细胞悬浮液。

2.在选取菌的时候要注意选择处于对数生长期，这个时期的细胞制备的感受态细胞活性最好。

3.在悬浮时可以用枪吸打以加快悬浮，缩短实验的时间。

4.感受态细胞最好是现制现用，这样既可以节约成本，又可以保证细胞的活性。

5.感受态细胞制好以后要提前检测一下电转是否炸杯。

实验14 重组片段的转化及克隆筛选

一、实验原理：

转化是指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转化技术在基因工程领域中占有极重要的地位。细胞膜在相关刺激下会产生孔洞，重组质粒可以通过这些孔洞而进入细胞。重组质粒含有抗性基因，含有重组质粒的细胞可以在抑菌物质的培养基上生长，即蓝白斑筛选过程。

二、实验目的：

通过本实验应学习和掌握重组片段转化及筛选的原理与方法。

三、材料与试剂：

材料：感受态细胞；

仪器：离心机，恒温摇床，恒温水浴，超净工作台，冰柜；

试剂：LB培养基，0.1N CaCl2。

四、操作步骤：

1. 现制感受态细胞或者将冰冻的感受态细胞在手心缓慢融化，加入溶于TE的待转化外源DNA，冰浴30min；

2. 43℃热冲击30s；

3. 加入1ml LB液体培养基，37℃保温30min-2h；

4. 7000rpm离心3min，收集菌体，用0.4mlLB液体培养基悬浮；

5. 取0.2ml菌悬浮液，涂布于有选择压的LB培养基上(4μlIPTG、20μlX-gal)，37℃保温过夜；

6. 计数，计算转化率。

五、结果与讨论：

1

1.如上图所示，次日取出培养基观察到有大量的白色小圆白斑分布于培养基上，同时也有蓝色的斑点。可见转化是成功的，白色的小斑点就是装入了重组质粒的细菌所产生的菌落。

2.同时有蓝色的斑点出现，说明抑制物质的量太少，还不能抑制不含重组质粒的细胞生长。建议下次实验加大抑菌物质的量。

3.在转入培养基培养时，培养皿一定要倒扣，保证菌的生长湿度，同时防止染杂菌。

4.热激转化的成本较低且效果较好。

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/2b0e75ebf011f18583d049649b6648d7c0c708c2.html