血蓝蛋白的测定方法

血蓝蛋白的测定

一、 紫外光比色法

1.采用紫外吸收法测定血蓝蛋白含量, 将抽取的血淋巴稀释为1%的溶液, 在紫外分光光度计上以334 nm 波长比色。血蓝蛋白含量就是在光径1cm下的光密度值的2.69倍（王顺昌, 许立.不同盐度下中华绒螯蟹血清总蛋白和血蓝蛋白含量的变化[J] .淮南师范学院学报, 2003, 5(3): 24-26.）。

2.将抽取的血淋巴稀释为1%的溶液，在U/V风光光度计上，以334nm波长比色（石英比色皿），血蓝蛋白含量=2.69E（1%，1cm）mmol.l-1（Nickerson K W, van Holde K E. A comparison of moluscan and, arthropod haemocyanin. I. Circular dichromism and absorption spectra [J]. Comp Biochem Physiol 1971, 39B: 855-872 ）。

3.吸取血淋巴 0.1 ml放入 0.5 ml 的离心管中，在匀浆前允许其凝固，然后用微型匀浆器匀浆血淋巴5分钟，经过15000rpm，4℃离心 15m。将上清液1：99与Tris-Ca 缓冲液（50 mM Tris HCl +10 mM CaCl2，pH = 8.0）混合。用分光光度计（UV-2600）以 Tris-Ca 为空白对照，重复测量 334 nm 处得吸光度得到血蓝蛋白的含量。血蓝蛋白浓度（mg/ml）的获得，通过计算 334 nm 处得吸光度乘于一个消光系数13.5，以及蛋白亚基为 74000 Da而得出（Johnson et al. 1984）。

二、酶联免疫吸附试验法

(1)将血淋巴样品用 PBS 稀释至适当的包被浓度（1-10μg/ml）。

(2)取96孔板，每孔滴加 100μl 待测样品，设重复组和阴性对照，每孔加入50μl 0.5 M EDTA 以抑制内源性酶 (Zhan et al., 2004)。（注：阴性对照用骨髓瘤细胞上清或 PBS；加样时样品应加在 ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，不可产生气泡）

（3）4℃包被过夜。（注：酶标板加盖或用保鲜膜封口以免蒸发）

（4）次日弃去包被液，每孔加满 0.05 % PBST 浸洗 3~5 min×3 次，在吸水纸上轻轻拍干。加入 PBS 配成的 5%的牛血清白蛋白（BSA）溶液 200 μl，37℃下封闭 1~2 h。（注：PBST 最好用排枪加，以减小人为误差；每孔加满约为 330 μl；PBST时要贴壁缓慢加入）

（5）甩干孔内溶液，PBST 洗 3×5 min，

（6）每孔滴加100μl一抗，37℃ 孵育 1 h。（注：一抗直接加到孔底，不要贴壁;最好用排枪加样，以排除人为误差；）

（7）PBST 洗3次×3~5 min，拍干。

（8）每孔滴加100μl AP 二抗，37℃1h。（注：直接加到孔底，不要贴壁；AP 二抗工作浓度为稀释4000倍）

（9）PBST洗3次×3~5 min，拍干。

（10）将 p NPP发色液加入酶标板避光发色 5~30 min，用2 mol/L NaOH终止发色。

(11) 酶标仪测吸光值A405 nm。（注：酶标仪预热数 15-30 分钟；值高于空白对照2.1倍以上为阳性；应保证酶标板清洁，避免指纹和划痕）。(中国明对虾血蓝蛋白的组织分布特点及斑症病毒感染后血蓝蛋白含量的变化.卢君辉.)

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/dfaf081bad02de80d5d84034.html