一、研究内容
关键科学问题: 神经元的发生和发育是一个多步骤、多因子参与的复杂过程。目前已知，胞外信号（包括生长因子、营养因子、神经活动）在神经元的发生、分化（极化）和神经网络形成过程中发挥着关键作用。这些胞外信号可以激活各种信号通路，从而启动一些对神经元发生、发育起关键作用的转录因子的mRNA表达和蛋白质合成。本项目将围绕神经元的发生、极化，突起的形态发生及其退行性病变，从分子、细胞到整体进行系统而深入的研究。
我们拟解决的关键科学问题是：揭示与神经细胞发生，极化，突触形成及神经退行性病变相关的重要信号分子（包括小G-蛋白及其偶联激酶）的功能并研究其作用机理，以及环境与遗传表型的关系。
主要研究内容:
（1）Rheb/mTor信号通路在神经元发生、极化、网络化及神经退行性病变中的作用及分子机制：
体外研究发现，mTOR信号通路对神经元的发生、发育起重要作用，而Rheb处于mTOR蛋白上游并对其起正调节作用，前期工作发现，Rheb1敲除小鼠的大脑发育出现明显异常。我们的初步研究表明小鼠中mTOR的激活需要与神经元早期发育密切相关的Rheb1。 Nestin-Cre介导的神经前体细胞敲除Rheb1导致小鼠大脑体积和重量均减少约50%。基于上述，我们计划深入研究Rheb/mTOR信号通路在神经元发生阶段作用和机制。预计本课题将帮助我们阐明Rheb1/mTOR信号通路在神经元发生作用和机制，为相关疾病的防治提供理论基础。
在肿瘤细胞中，我们已知LKB1抑制mTOR信号通路。最近研究表明LKB1调节神经元的极化，我们初步结果显示在神经前体中敲除Rheb1会导致大脑皮层厚度下降，由此推断Rheb/mTOR信号通路有可能参与神经元极化调控。由此，我们将研究Rheb1/mTOR信号通路在神经元极化中的作用和分子机制。预计通过本课题的研究将确定Rheb/mTOR信号通路是神经元极化所必需的，同时将为进一步揭示Rheb调控神经元发生分子机制，为相关疾病防治提供新途径。
体外研究表明，抑制mTOR会减少神经元树突棘的形成。由于Rheb1缺失会导致mTOR完全失活，我们推断Rheb1的敲除会引起树突和树突棘形成的缺陷。我们初步数据表明Rheb1敲除将降低突触后骨架蛋白Shank3的表达。Shank3是树突发育的必需因子，所以Rheb1可能通过提高Shank3的表达调节树突生长。我们将通过本课题的研究确定Rheb/mTOR/Shank3信号通路在树突和树突棘形成中的作用和分子机制，并揭示它在行为神经网络形成中的作用。
此外， 我们的研究显示，Rheb1敲除小鼠脑体积比野生型减小约50%，小脑皮层的厚度及海马体大小也均减少约50%。且Rheb1敲除小鼠小脑体积显著减少，其只有五个小脑叶片而正常小脑为七个。上述所有这些发育缺陷可能由于Rheb1敲除小鼠神经祖细胞的增殖率减慢和（或）脑发育过程中神经干细胞/祖细胞群的早期损失引起。大量研究表明mTor信号在多个细胞系中具有抑制自噬的作用，我们前期研究发现，Rheb1中枢神经系统敲除小鼠所有脑区域中mTor活性被显著抑制。因此，我们推测Rheb1敲除小鼠由于缺失mTor信号发生过度自噬，从而导致神经祖细胞增殖率减慢及脑发育过程中神经干细胞/祖细胞群的早期损失，最终导致其脑发育异常。本课题的研究将确定Rheb1/mTOR通路介导的自噬抑制在维持神经祖细胞生存和增殖中的功能及Rheb1/mTOR信号异常是否引起线粒体自噬异常从而导致神经祖细胞受损。
（2）与铁离子代谢相关基因在神经元发生、极化和网络化中的作用及分子机制：
研究结果表明，铁离子与神经元的发育密切相关，但其分子机理尚不清楚。为深入研究铁离子和铁转运蛋白在脑神经发育中的分子机理，我们将在神经前体细胞中敲除铁离子运输基因包括铁转运蛋白受体（Transferrin Receptor，TFR）、二价金属转运体（DMT1）和运铁素（Ferroportin，Fpn或SLC40A1)。 铁转运蛋白受体主要摄取转铁蛋白结合铁（Transferrin-bound iron，Tf-Fe），二价金属转运体主要摄取非转铁蛋白结合铁（Non-Transferrin-bound iron，NTBI），而运铁素在机体内唯一具有从细胞内泵出铁离子的蛋白。这三个基因涵盖了细胞摄取和泵出铁离子的主要通路。通过本课题的研究我们将确定铁离子转运在神经元发生过程中的作用和机理，为防治铁离子代谢失调引起的神经性疾病奠定基础。
并且体外试验已经表明Numb调节神经元的极化。铁离子、转铁蛋白与内吞调节蛋白Numb共同参与内吞功能，但在脊椎动物中还未有遗传学证据证明这些分子介导的内吞调节神经元的极化。本课题将以这些基因敲除小鼠为模型，运用多种前沿生物学技术阐明中枢神经系统神经元摄取、泵出铁离子的通路和内吞调节蛋白Numb/Numblike在神经元极化中的作用及分子机制。课题的研究将确定TFR、DMT1、Fpn、numb和numblike信号通路是否是神经元极化所必需的，同时将为进一步揭示它们调控神经元极化的分子机制，为相关疾病的防治提供新的途径。
如前所述，铁离子、转铁蛋白与内吞蛋白Numb共同参与细胞的内吞过程。而在神经元中，内吞功能对树突发育、树突棘形成和可塑性产生都非常重要，但是铁离子的内吞转运和Numb在这些过程中的作用还不清楚。为此，我们将研究确定TFR、DMT1、Fpn、numb和numblike信号通路是否是神经元树突、树突棘形成所必需的，为进一步揭示TFR、DMT1、Fpn、numb和numblike信号通路调控神经树突、树突棘形成的分子机制打下基础。
（3）研究Gsα在神经元极化中的作用及分子机制：
我们的前期工作表明异三聚体G蛋白的亚基Gs 调节神经前体细胞的不对称性分裂和细胞极性，Emx1-cre介导的在大脑的神经前体细胞中敲除Gs 导致大脑的重量减轻50%和产后月内死亡。虽然我们已在Gs 介导对神经前体细胞不对称细胞分裂的调控方面取得显著进展（被资助），最近体外和遗传学研究提示Gs 还有可能参与神经元极化的调节，但其中的机理尚待研究。通过本课题的研究将确定Gs 信号通路是神经元极化所必需的，并进一步揭示Gs 信号通路调控神经元极化分子机制。
（4）BDNF在神经元网络化中的作用及分子机制：
BDNF几乎在神经元的各个发育阶段都具有重要功能。其基因突变Val66Met导致它在神经元内活性诱导分泌缺陷，因而造成精神疾病，但是具体的分子机制还不清楚。 为此我们建立了BDNFmet转基因小鼠模型。 此模型真实反映BDNFmet相关精神疾病的行为特点。预计本课题的研究将确定BDNFmet在树突和树突棘形成中作用和分子机制，及对神经传递的调节，进一步深化理解BDNFmet诱导精神疾病的发生病理及环境因素对BDNFmet精神疾病的影响，发现治疗BDNFmet诱导精神疾病的介入方式。
（5）线粒体自噬在神经元发育和退行性病变中的功能及调节机制：
线粒体自噬是细胞控制线粒体数量和清除受损线粒体的唯一途径。线粒体自噬不足会导致受损线粒体的积累，引起细胞凋亡；而线粒体自噬过量会导致ATP水平下降，引起细胞的自噬性死亡。由于神经元对线粒体的正常运行具有特别高的要求，它们必须具备精细的线粒体自噬调节机制，以将它控制在适当水平。在本课题中，我们将运用细胞筛选方法分离线粒体自噬的促进因子和抑制因子，通过研究它们的生化功能，揭示线粒体自噬特有的调节方式。进一步通过研究它们在神经元发育和退行性病变过程中的作用和变化，阐明线粒体自噬在神经系统中的功能和调节机制，为发展相关神经疾病的新一代防治方法提供理论基础。
二、预期目标
总体目标：
确定在神经细胞发生发育及退变过程中起重要作用的信号分子，阐明在该过程中胞外信号如何通过细胞内信号传导发生作用，为防治神经精神性疾病提供理论依据，并为相关疾病研究建立动物模型。
五年预期目标：
1、 对神经细胞发生，极化，突触形成，及神经退行性病变的机理研究有所突破，明确Rheb/mTOR通路在神经元发育及退行性病变中的作用和机理，确定是否可通过干预mTOR通路治疗神经精神疾病。
2、 利用制备的条件性基因敲除小鼠建立一系列特异小鼠模型，确定信号蛋白的不对称分布和膜蛋白内吞在神经元发育和退行性病变中作用及机理。
3、 明确变性蛋白、老化线粒体的清除与退行性病变的关系，建立以干预线粒体自噬活力为基础的神经精神疾病治疗方法。
4、 建立和完善小鼠遗传学，活体影象等公用技术平台。
5、 研究成果将在国际高水平杂志上发表，预期发表影响因子IF≥10的10-15篇。
6、将在今后5年内培养出4-5名领军型人才，研究生50-100名。
三、研究方案
总体研究方案
项目拟以神经元为研究核心，分别围绕神经元的发生与极化，神经突起的形态发生，以及神经元退行性病变的分子机制等问题，从分子、细胞乃至整个机体的层次进行系统而深入的研究。我们希望通过构建一系列神经细胞特异性基因敲除小鼠，结合多种现代生物学前沿技术，如高分辨荧光染色影像分析、基因工程报告小鼠、免疫共沉淀、RNA干扰等，阐明上述问题的分子机制，为进一步的研究和临床治疗打下坚实基础。本课题立意新颖，技术先进，重点突出，内容具体，具有极大的理论研究意义和实际应用价值。技术路线如右图所示：
本项目的特色与创新性：
1． 立题新颖：我们的研究将首次揭示胞内调控因子，如Gsα、Rheb和Fe，在神经元分化发育过程中的作用和机制。本项目的研究内容处于当代生命科学的前沿，国内外均未见类似的研究报道。
2． 技术先进：我们将大量采用目前世界上先进的生物学研究手段，如条件性基因敲除和报告基因技术（如Rosa26-GFP），荧光标记和成像（如catFISH）等，着重在体内研究基因在神经元发生和发育中的作用。
3． 取得重大突破的可能性大：参与本项目的科学家积累了大量前期工作的基础，在Cell ，Nature，Science，Nature Genetics，Nature Neuroscience，Neuron，Moleculler Cell，Development，Genes Development等世界顶级杂志上发表论文26篇，影响因子达520，被引用次数达6000多次。该项目应用先进的技术手段，在大量前期工作基础上，研究神经元的发生、极化、树突形成及退变的分子机制等神经发育生物学的重大问题。项目所需关键条件性基因敲除小鼠和Cre小鼠已制备（如下图），因此，取得重大突破的可能性极大。
4． 神经系统发生发育的基础研究与临床疾病紧密相关。神经元生理功能和调节的失调将导致神经元退行性病变，如老年性痴呆症和帕金森氏病，我们对相关机制的阐明将有利于寻找新的药物靶点，开发新的神经元保护药物，从而为治疗神经疑难疾病发现新途径。
课题设置: 1) 神经元发生的分子机制：重点研究Rheb/mTOR信号通路和铁离子在神经元发生中的作用和机制；2) 神经元极化的分子机制：重点研究G-蛋白信号通路（Gsa,Rheb）和铁离子在神经元极化中的作用和机制；3) 神经元突起形态发生的分子机制：着重研究生长因子BDNF、Rheb和铁离子在神经元突起形态发生的作用和机制；4) 神经元退行性病变的分子机制：侧重研究线粒体自噬和Rheb/mTOR信号在神经元退行性病变中的作用和机制。
各课题既重点突出、内容具体、责任明确, 又互相合作、相互促进。各课题之间将在资源、技术和人才三方面充分实现共享，我们将共同利用多品系的基因敲除小鼠进行各课题相关基因功能的研究，节约大量的人力和经费，并且互相学习先进实验技术和交换专业人才，提高科研效率。
课题设置具体如下：
课题一：神经元发生的分子机制
负责人：肖波, 44岁, 教授，博士生导师，四川大学
预算经费：占20％
主要内容
我们将利用基因敲除小鼠深入研究Rheb/mTOR信号通路调节神经元发生的分子细胞机制（包括神经干细胞的自我更新、增殖和分化）以及铁离子转运调控在神经元发生中的作用和分子细胞机制。
预期目标
确定Rheb/mTOR信号通路和铁离子转运在体内神经元发生中的作用和调节机制，为相关疾病的防治提供理论基础。预计发表SCI IF>10的科学论文2-3篇。 在今后5年内培养出1-2名领军型人才，研究生15-20名。
课题二：神经元极化的分子机制
负责人：沈颖，37岁，教授，博士生导师，浙江大学。
预算经费：占30%
主要内容
我们将利用大脑神经元特异的基因敲除技术研究参与铁离子运输的转铁蛋白受体、泵铁蛋白(ferroportin)、决定细胞极性的内吞分子numb/numblike、氨基酸感受信号通路蛋白Rheb1和感受外源因子的信号分子Gsα在神经元极化中的作用和分子机制。
预期目标
确定G蛋白（Gsα和Rheb）和铁离子在体内神经元极化的作用和分子机制，为神经再生、神经、精神疾病的研究和新药的开发提供指导。预期发表影响因子IF≥10的3-5篇，在今后5年内培养出1-2名领军型人才，研究生20-30名。
课题三：神经突起形态发生的分子机制
负责人：陈哲宇，33岁，教授，博士生导师，山东大学
预算经费：占30%
主要内容
我们计划结合分子生物学、光学成像、电生理学技术阐明铁离子代谢、numb/numblike介导的内吞噬、BDNFmet、Rheb/mTOR信号通路在树突形态发生中的作用和分子机制，探究树突发育和神经环路形成的分子机制以及某些发育性神经疾病的机理。
预期目标
确定BDNFmet、Rheb1/mTOR、Shank3和铁离子在神经突起形态发生中的分子机制，为神经、精神疾病的研究和新药开发提供指导。预计发表SCI IF>10的科学论文3-5篇，在今后5年内培养出1-2名领军型人才，研究生20-30名。
课题四：神经元退行性病变的分子机制
负责人：姜长安，37岁，教授，博士生导师，四川大学
预算经费：占20%
主要内容
我们将侧重研究线粒体自噬和Rheb/mTOR信号在神经元退行性病变中的作用和机制。运用细胞筛选方法分离线粒体自噬的相关因子，揭示线粒体自噬特有的调节方式，进而研究它们在神经元发育和退行性病变过程中的作用和变化，阐明线粒体自噬在神经系统中的功能和调节机制，为发展相关神经疾病的新一代防治方法提供理论基础。
预期目标
确定线粒体自噬和Rheb1/mTOR信号通路与神经退行性病变的相互关系及相关机制，为神经、精神疾病的研究和新药开发提供指导。预计发表SCI IF>10的科学论文2-3篇，在今后5年内培养出1-2名领军型人才，研究生15-20名。
四、年度计划
本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/d9ad45465ebfc77da26925c52cc58bd631869394.html
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