麻醉学研究生开题报告

（一） 研究意义

临床麻醉中各种原因引起围术期的心肺功能受损，如心跳骤停、急性呼吸道梗阻等，都会不同程度的存在脑缺血再灌注损伤。麻醉期间意外发生率为5.2～44.3/万，猝死率为2.8～7.0/万[1]。急救过程中，脑复苏环节是保证远期复苏效果的关键。现阶段大多数对脑缺血再灌注损伤干预措施的研究集中于缺血再灌注损伤发生前的预处理，报道对脑缺血再灌注损伤有预防作用的涉及地氟烷[2]、异氟烷[3]、异丙酚[4]、氯胺酮[5]等等众多临床常用药物。

由于临床意外难以预见，及在脑缺血再灌注后死亡细胞和凋亡细胞的不可逆性，预处理的思路常常无助于临床意外中对脑损伤的治疗。我们认为改善缺血再灌注后脑的功能，应该积极关注脑缺血再灌注后的变性神经元，建立稳定，可靠，适用于对脑缺血再灌注损伤后变性神经元救治实验的动物模型具有探索价值。

　羟考酮主要作用部位是中枢神经系统, 其次是平滑肌, 其药理作用主要是镇痛, 其他还包括镇咳、缩瞳、恶心、呕吐、瘙痒、呼吸抑制、胃肠蠕动降低等。研究认为羟考酮的镇痛作用可能与μ、κ受体有关 , 尽管其精确作用机制现在还不明确, 但现已确定羟考酮产生呼吸抑制是通过直接作于脑干呼吸中心, 其镇咳是通过直接作用于髓鞘咳嗽中心而起作用 。羟考酮精神依赖性的形成与纹状体多巴胺释放量增加有关 。

（二）国内外研究现状

1 脑缺血再灌注损伤的机制

一般认为在生理情况下，神经元以氧化磷酸化的方式提供足够的ATP维持细胞的正常代谢活动。缺血时，氧和葡萄糖供应停止，能量代谢先受累，此时神经元以无氧酵解的方式可提供少量ATP以维持细胞完整性。但由于无氧酵解过程中产生过量乳酸，使细胞酸中毒，而神经递质的合成、释放和摄取均受PH的影响，因而神经元的功能遭到破坏。例如能量障碍引起Na+丢失，使突触前膜去极化，导致兴奋性神经递质谷氨酸释放增加，又由于酸中毒使谷氨酸摄取受阻，突触隙内有谷氨酸堆积，通过大量激活其NMDA受体，致Ca2+内流增加，胞内钙超载，但此时依赖能量的离子泵Ca2+受损，无法将Ca2+排出胞外，细胞内过量的Ca2+引发一系列生化反应，如自由基及过氧化物生成，细胞因子释放及炎症反应等，最终造成对神经元的损害，但其中许多环节尚未阐明，有待更多学者的进一步研究。[6]

2目前关注的脑保护的方法有：

（1） 低温[7]；

（2） 麻醉药物的应用（包括吸入麻醉药、静脉麻醉药及某些局麻药）[8]；

（3） 血液稀释；

（4） 离子通道阻滞药、自由基和脂质过氧化酶抑制剂[9]；

（5） 预处理，包过药物预处理和缺血预处理[10]；

（6） 中药参附注射液、川穹嗪等[11]

3羟考酮与脑缺血再灌注损伤

正常时海马结构包括：连合前海马、灰被、束状回、海马、齿状回以及下托。海马可分为四个区：CA1:海马水平部的背内侧部分和垂直部的后内侧部分；CA2：海马水平部的背外侧部分和垂直部的前外侧部分；CA3：海马水平部的腹外侧部分和垂直部的前内侧部分；CA4：冠以齿状回的部分，即齿状回的多形细胞层。从海马的脑室面向海马沟观察，可见下列层次：室管膜层、槽层、多行细胞层、椎体细胞层、辐状层、腔隙层和分子层；再向外则是齿状回的分子层、颗粒层和多行细胞层。正常海马CA1区2-3层锥体细胞，胞体短径10-20μm，长径20-30μm，细胞排列紧密，层次分明，核大而圆，核膜完整，核仁清晰，核染色质均匀[12]。

国内有报道沙土鼠缺血再灌注后CA1区多数神经元变形坏死，表现细胞肿胀，胞浆内形成空泡，核呈不规则固缩，深染等，甘露醇治疗组仅有个别神经元变性坏死。可见从形态学角度说明甘露醇有神经元保护作用。但这方面小鼠的实验报道不多。

4目前常见的全脑缺血动物模型：

（1）双动脉阻断法（同时阻断双侧颈总动脉和基底动脉）[13]

（2）三动脉阻断法（同时阻断双侧颈总动脉和基底动脉）[14]

（3）四动脉阻断法（同时阻断双侧的颈总动脉和椎动脉）[15]

三动脉阻断法和四动脉阻断法的缺血程度较双动脉阻断法为重，再灌注后的脑组织也会不同程度的产生梗死灶，梗死灶周边的变性细胞或散在分布，或和梗死灶重叠，不能形成较好的观察区域。

双动脉阻断法建立小鼠全脑缺血再灌注损伤模型，用激光多谱勒灌注监测仪测定，在缺血后10 min脑皮质血流为缺血前脑皮质血流的22.3%[16], 接近大多数临床意外时脑缺血的情况，且对实验动物造成的应激性生理及病理反射较小[17]。

实验观察了昆明小鼠双颈总动脉阻断30～120 min再灌注24 h后的脑缺血再灌注损伤效果，通过分析海马CA1区细胞的形态学特点，认为昆明小鼠缺血60 min再灌注24 h造成的损伤程度适中，不同程度的受损细胞比例均衡，可作为以变性神经元为观察对象，在脑缺血后实施干预的脑缺血再灌注损伤动物模型，相对于其他实验动物及模型制作方法，具有成本低廉、操作简便、重复性好的特点。

在此实验动物平台上分别成功的进行了脑缺血再灌注损伤后纳洛酮和皮质激素干预效果的观察和评价。

本课题就是在上述同学的工作基础上，进一步完成脑缺血再灌注损伤后不同时间甘露醇脱水治疗的效果评价和实验动物观察。

【主要参考文献】

[1] 王玉明，李小平，李江明.麻醉与猝死.北京军区医药[J].1999,11(5):365-368

[2] 罗芳，候丽贤，王恩真,等.地氟烷对全脑缺血再灌注损伤大鼠脑神经元及细胞骨架的可能性保护作用.中国临床康复[J].2005,9(14):215

[3] 孙永海，岳云，王云.异氟烷预处理对大鼠全脑缺血损伤的保护作用及递质机制.军医进修学院学报[J].2005,26(5):392-394

[4] 郭建荣，崔健君，黄长顺,等.异丙酚对脑缺血再灌注损伤大鼠海马组织细胞间黏附分子-1及核转录因子-κB表达的影响.中华麻醉学杂志[J].2005,25(2):122-125

[5] 范圣登，谢红，王明才,等.氯胺酮对大鼠全脑缺血再灌注损伤的预防与治疗作用.江苏医药杂志[J].2003,29(10):741-742．

[6] 彭静，鄢建勤.乌司他丁与脑保护，2007麻醉学新进展，2007：46~47

[7] 包正夫, 徐　蔚. 低温脑保护技术的现状与进展[ J ]. 昆明医学院学报,2007,24 (1) : 107~109

[8] 陈伯蛮李德馨. 麻醉药对脑功能和脑代谢的影响和脑保护[ J ]. 《国外医学》麻醉学与复苏分册，2003，24(1)：1~2

[9] 曲友直，高国栋，赵振伟等. 甘露醇、尼莫地平及其两药联合应用对脑缺血大鼠神经保护作用的机制研究[ J ]. 中国临床康复，2004，8（4）：658~659

[10] 甘国胜, 王焱林. 药物预处理在颅脑手术围术期的脑保护作用的研究进展[ J ]. 中国误诊学杂志,2006 ,6 (8):1443~1445

[11] 王　瑜. 中药治疗脑缺血及对脑保护作用的研究[ J ]. 中医药学刊，2 0 0 2 ，2 0

[12] 王平宇，朱治远，等．大白鼠中枢神经系统解剖学基础．2003：34~39

[13] EklofB, Siesjo BK. The effect of bilateral carotid artery ligation upon the blood flow and the energy state ofthe rat brain [ J ]. Acta Physiol Scand, 1972, 86:155~165.

[14] Kameyama M, Suzuki J , Shirane R, et al. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the rat three vessel occlusion model [ J ]. Stroke, 1985,16: 489~493.

[15] PulsinelliWA, Brierley JB. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat [ J ].Stroke, 1979, 10: 267~272.

[16] 卢晓梅,金玉梅. 灯盏花素对小鼠脑缺血再灌注损伤的影响[J]. 锦州医学院学报,2006,27(1):44-46

[17] 贾栋，高国栋.大鼠全脑缺血/再灌注模型之比较研究.卒中与神经疾病[J].1999,6(3):145-148

（一）研究目标、研究内容和拟解决的关键问题

1. 研究目标

探索不同时间羟考酮处理对小鼠全脑缺血再灌注损伤干预效果的影响。

2. 研究内容

（1）光镜下观察正常小鼠海马CA1区神经元的形态学表现

（2）光镜下观察不同处理组小鼠海马CA1区神经元的病理形态学变化

（3）光镜下观察不同时间甘露醇干预后的小鼠海马CA1区神经元的病理形态学变化

3. 拟解决的关键问题

（1）按照郗东峰同学的方法建立小鼠脑缺血再灌注损伤模型。

（2）准确完成不同时间的甘露醇干预

（3）完整取脑，正确选取观察部位的脑组织。

（4）客观描述病理形态学标本所见

（5）准确统计病理形态学指标

（6）适当的统计学处理，导出实验结论

（二）拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

1. 研究方法

健康昆明小鼠42只，随机分为对照组、假手术组、缺血再灌注损伤组和羟考酮干预组。按照结扎双侧颈总动脉法制备小鼠脑缺血再灌注损伤模型。进行脑组织海马CA1区神经元细胞计数，光镜观察海马CA1区神经元病理形态学的改变，并计算变性细胞率。

2. 技术路线

再灌注24h后取脑组织固定、石蜡包埋切片

数据处理、统计学分析、得出结论

HE染色光镜细胞计数、形态学观察

3 实验方案

（1） 实验分组：

健康昆明小鼠42只（山西省肿瘤医院实验动物中心提供），雌雄不分，体重20±2克左右，随机分为对照组（A组，n=6）、假手术组（B组，n=6）、缺血再灌注损伤组（C组，n=6）和再灌注即刻羟考酮干预组（D1组，n=6） 、再灌注30min羟考酮干预组（D2组，n=6） 、再灌注1h羟考酮干预组（D3组，n=6）和再灌注1.5h羟考酮干预组 （D4组，n=6）。D组给予羟考酮1g/kg腹腔注射。

（2） 动物模型制备：

手术在室温25℃、湿度50%的条件下进行。用0.6%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（60mg/kg），络合碘消毒，铺单，行颈部正中切口，分离两侧颈总动脉，用3-0丝线打活结阻断颈总动脉，1h后实现再灌注。缝合切口，置清洁饲养笼中观察。 A组既不手术也不给药。 B组只分离双侧颈总动脉，穿线，但不结扎。 C组分离双侧颈总动脉，结扎 1h后再灌注，但不给药。 D1 、 D2 、 D3 、 D4组分别在再灌注即刻、30min、1h和1.5h腹腔注射甘露醇1g/kg。各组再灌注24h后0.6%戊巴比妥钠（90mg/kg）腹腔注射麻醉，迅速取脑。

（3） 检查指标和方法

标本置于4%多聚甲醛液中固定24h后，取视交叉后的组织，常规石蜡包埋，冠状切片，片厚5μm,苏木精-伊红染色（HE染色），光镜下在有测微尺显微镜下（×10）计数海马CA1区2mm范围内核完整的存活细胞数（自CA1区始点起），并观察海马CA1区细胞形态变化，并计算变性细胞率。

（4） 统计分析：

实验数据以均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析，组间进行多重比较，各组变性细胞率用X2检验比较，SPSS11.5统计软件分析，P＜0.05认为有显著性差异。

4. 可行性分析：

（1）2005级研究生吴晓阳已经建立了稳定的小鼠全脑缺血动物模型。2006级研究生田彦鹏在此实验动物平台上分别成功的进行了脑缺血再灌注损伤后纳洛酮和皮质激素干预效果的观察和评价。

（2）本实验参考大量相关文献。

（3）实验经费已落实。

（三）本课题的创新之处

（1）国内多数报道的是脑缺血再灌注损伤前的药物干预，以梗死和凋亡为观察指标。本课题利用小鼠脑缺血再灌注损伤模型，再灌注后采用甘露醇干预，以变性细胞为观察指标。

（2）本课题通过观察不同时相应用甘露醇后的效果，为临床应用寻找合适的时间，从而为临床心肺脑复苏提供实验依据。

（四）研究计划及预测进展

2015年7月——2015年11月 文献检索及撰写综述

2015年12月——2016年2月 实验准备、预实验

2016年3月——2017年6月 实验阶段

2017年7月——2017年9月 实验数据处理、论文撰写

（五）.预期研究成果

（1）以形态学为依据，证明羟考酮再灌注后干预可改善小鼠脑缺血再灌注损伤，起到脑保护的作用，而且羟考酮干预的时间应该是越早越好，为临床救治过程中的心肺脑复苏的药物治疗提供了理论和实验依据。

（2）预期提交学术论文1-2篇。