植物基因克隆的策略与方法
基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997,为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。
1功能克隆(functionalCloning
功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,(2将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。
Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成
酶基因(Vst1和Vst2,葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对灰质葡萄孢(Botrytiscinerce的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因经过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性很有意义(Hain等,1985。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DNA做了克隆和序列分析(Kondo等,1989。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(CucumberMosaicvirus(CMV,并克隆了编码该病毒外壳蛋白的cDNA基因(胡天华等,1989。王春香等从感病的烟草叶片中分离纯化了马铃薯x病毒(potatovirusX,pvx,克隆了完整的马铃薯x病毒外壳蛋白基因,并将外壳蛋白基因转入马铃薯中,以期获得抗pvx病毒的栽培种马铃薯(王春香等,1991。病毒外壳蛋白(Coatproteincp基因的成功克隆,可使转基因植物中产生病毒外壳蛋白基因介导的抗性(CoatProteinMediatedResistanceCPMR或病毒CP-RNA介导的抗性。Vankan报道从真菌中成功的克隆出无毒基因Avr9,可直接利用此基因介导广谱高效的基因工程植物(VanKan等,1991。我们1995年构建了天麻cDNA文库,制备抗体探针成功地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因的cDNA克隆,为抗真菌基因在农业、医药等方面的应用打下了基础(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997。功能克隆的特点是用基因表达的产物蛋白质来克隆基因、虽然某一性状
的编码基因是未知的。如果对其生理生化及代谢途径研究的比较清楚,就可以分离和纯化控制该性状的蛋白质。因此功能克隆的关键是分离出一个纯度很高的蛋白质。只要有一个纯的蛋白质,得到十分特异的探针,这一策略是行之有效的。采用功能克隆方法虽然已经克隆了很多基因,但由于绝大多数基因的产物目前还不知道。所以大多数基因难以用这一经典的方法来克隆。随着分子生物学技术的发展,一条新的基因克隆策略逐渐形成,这就是定位克隆。2定位克隆(Positionalcloning
根据遗传连锁分析,染色体步移将基因定位到染色体的一个具体位置上后不断缩小筛选区域进而克隆该基因,研究该基因的功能或抗性的生化机制,这样一种策略叫定位克隆(Monaco,1994。连锁分析即通过基因与
