活性蛋白整体方案网址：www.DetaiBio.com 多聚组氨酸标签（His-tag ）关键词：His-tag 融合蛋白，多聚组氨酸标签，Ni-IDA ，Ni-NTA ，Ni 2+亲和层析柱描述：本文描述了多聚组氨酸标签（His-Tag ）融合蛋白亲和层析的基本原理，优势，以及实验操作流程。固定化金属离子亲合层析(Immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)，简称金属螯合亲合层析，是一种新型的应用于原核蛋白纯化的技术。该方法通过蛋白质表面的一些特殊的氨基酸，使之与金属离子发生相互作用，从而对蛋白质进行亲和纯化。这些作用包括配价键结合、静电吸附、共价键结合等，其中以6个组氨酸残基组合的融合标签（His-Tag ）在原核蛋白表达中的应用最为显著。His-Tag 可结合在目的蛋白的C 末端或N 末端，形成特殊的结构，以便于进行下一步的纯化及检测。由于金属螯合亲合层析具有配体简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，所以可选择范围广，高盐，存在变性剂以及去垢剂的上样条件下进行纯化，His-Tag 正逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。His-tag 作为蛋白纯化时的首选标签，其优势在于：1.N-端的His-Tag 与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达；2.采用IMAC （固定化金属离子亲合层析）纯化His-Tag 融合蛋白操作更加简便；3.His-Tag 对目的蛋白本身特性几乎没有影响，不会改变目的蛋白本身的可溶性和生物学功能；4.His-Tag 非常小，在融合蛋白结晶后对蛋白的结构没有影响；His-Tag 的免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体；5.与其它亲和标签构建成双亲和标签，并可应用于多种表达系统；His-Tag 融合蛋白的适用范围也较广，既可以在非离子型表面活性剂存在的条件下纯化，也可以在变性条件下进行纯化。前者通常用来纯化疏水性强的目的蛋白，而后者则通常纯化包涵体蛋白。His-Tag 亲和层析填料His-Tag 可与多种金属离子发生特殊的相互作用，如Ca 2+、Mg 2+、Ni 2+、Cu 2+，Fe 3+等，其原理是利用蛋白质表面的特性，使之被吸附在凝胶柱上，从而达到分离纯化蛋白的目的。Ni 2+在亲和纯化实验中的使用最为广泛。根据结合基团的不同，Ni 2+亲和层析柱可分为俩类——Ni-IDA 和Ni-NTA 。Ni 2+有六个螯合价位，其中Ni-IDA 螯合了三价，Ni-NTA 螯合了四价。所以IDA 的载量要比NTA 的高，在同样条件下Ni-IDA 洗脱时的咪唑浓度也高于Ni-NTA 。但其弱的结合力使金属离子在洗脱阶段时很容易浸出，与目的蛋白紧密结合，从而导致分离蛋白产量偏低，产品不纯及金属离子污染等问题。而NTA 的颗粒粒度均匀，粒径更小，并且螯合镍更稳定，能耐受较高的还原剂，使填料更加稳定，镍离子不易脱落。IMAC 在通常的情况下是比较稳定的，但螯合剂的存在则会导致其金属离子脱落。例如在E.coli 的裂解液中
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