T7RNA 聚合酶的克隆及其介导基因转录功能的鉴定虞结梅,杨 兵,谢 灿,陆燕燕,何金生2007-03-02接收基金项目:国家自然科学基金(编号:30471519)作者单位:安徽医科大学免疫学教研室,合肥 230032作者简介:虞结梅,女,24岁,硕士研究生;何金生,男,42岁,博士,教授,硕士生导师,责任作者,E 2mail:he_jinsheng@hot m ail .com摘要 目的 构建含T7RNA 聚合酶(T7RNA Poly merase,T7RNP )的真核表达载体,同时构建含T7启动子、增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Pr otein,EGFP )和T7RNP 转录终止信号的载体,并通过观察EGFP 的表达推测T7RNP 表达和T7表达系统介导基因转录的功能。方法 根据编码T7RNP 的基因序列,应用PCR 技术从含有T7RNP 基因的E .coli BL21(DE3)基因组中扩增编码T7RNP的基因片段,克隆至载体pc DNA 311(+)。同时从px8δt 载体和pGE M 2T easy/EGFP 上切下T7RNP 识别的终止信号(ter m inat or,TER )和编码EGFP 的基因,克隆至载体pc D 2NA II 。将获得的两个重组质粒共转染BHK 细胞。48h 后,通过观察EGFP 基因在真核细胞内的表达情况,推测T7RNP 基因的表达及表达后识别T7启动子介导基因转录功能。结果 成功构建了含T7RNP 编码基因的真核表达载体pc DNA 311(+)/T7RNP 和原核表达载体pc DNA II/EG 2FP /TER,共转染BHK 细胞后,可观察到EGFP 表达的绿色荧光。结论 T7RNP 能顺利在真核细胞内表达,并通过与T7启动子和TER 的相互作用,成功实现了EGFP 基因的转录和表达。主题词 细菌噬菌体T7/遗传学;转录,遗传中图分类号 R 345157;R 378;R 394233;R 39412;R 97713文献标识码A 文章编号1000-1492(2007)03-0272-04 T7噬菌体是一种中等大小的噬菌体,其线状双螺旋DNA 由39936bp 组成。它的基因1可以编码T7RNP,T7RNP 是一种依赖DNA 的RNA 聚合酶,同时也是T7噬菌体编码的唯一RNA 聚合酶,其编码基因长度为2652bp 。与许多其他RNA 聚合酶不同的是,该酶是一个单体酶[1],由883个氨基酸组成,分子量为98ku,可以识别所有晚期启动子而介导转录。并且,与细菌RNA 聚合酶相比,T7RNP 识别的序列更具有特异性、转录的效率也更高。在负链RNA 病毒的反向遗传学研究中,该酶常被用于将负链RNA 病毒的感染性c DNA 转录为病毒基因组。本文旨在构建T7RNP 真核表达载体pc DNA 311(+)/T7RNP,并观察T7RNP 在真核细胞内表达及其与T7启动子和TER 相互作用所介导的转录功能。从而为进一步构建负链RNA 病毒载体并开展反向遗传学研究奠定基础。1 材料与方法1.1 材料 质粒px8δt 为德国Munich 大学的Con 2zel m ann 教授馈赠,E .coli BL21(DE3)、E .coli .DH5α、pc DNA 311(+)、pc DNA II 、pGE M 23zf (+)、pGE M 25zf (+)及含有EGFP 的pGE M 2T/EGFP 和小仓鼠肾细胞株BHK 细胞系为本实验室保存,T4DNA 连接酶、质粒提取及纯化试剂盒、PCR 片段回收及纯化试剂盒、PCR Marker 、Taq DNA 聚合酶、Pfu DNA 聚合酶均购自上海Pr omega 公司;dNTP 、脂质体转染试剂盒L i pofecta m ine 2000购自I nvitr ogen 公司,I PTG 及X 2gal 购自华美物工程公司;蛋白酶K 、限制性内切酶为大连宝生物公司产品,引物合成及DNA 测序由上海博亚生物工程公司完成。1.2 PCR 引物 据已知的T7RNP 基因编码序列[2],设计一对引物T 2721、T 2722。T 2721:nt12nt24:5′G AT AT C CAC CAT G AA CAC G AT T AA CAT CGC T AA G 3′,其中G AT AT C 为Eco R V 酶切位点;T 2722:nt28172nt2791:5′CTC G AG TT A CGC G AA CGC G AA CGC G AA GTC CG A CT C T AA 3′,其中CT C G AG 为X ho Ⅰ酶切位点。经计算机PCR 引物设计软件分析,由上海博亚生物工程公司合成。1.3 目的基因的克隆 提取E .coli BL21(DE3)的基因组DNA ,方法参照文献[3]。以含有T7RNP 基因的基因组DNA 为模板,Taq 酶和Pfu 酶对半量进行常规PCR 。获得的PCR 产物回收后平连至经Eco R V 处理的载体pGE M 25zf (+),再利用X ho Ⅰ、Eco R V 和Sca I 酶切pGE M 25zf (+)/T7RNP 并回收T7RNP,最后与经X ho Ⅰ和Eco R V 酶切处理的pc D 2NA 311(+)载体进行连接,得到的重组体命名为pc DNA 311(+)/T7RNP,酶切鉴定后测序。从载体px8δt 上利用B am H I 切下TER 片段并回收,部分补平,同时从pGE M 2T/EGFP 上利用Eco R V 和N ot I切下EGFP 并回收,将TER 克隆至用X ba I 消化并部分补平的pGE M 23zf (+),测序TER 序列倒装,利・272・安徽医科大学学报 A cta U niversitatis M edicinalis A nhui 2007Jun;42(3)
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