番茄果实RNA提取方法比较

发布时间：2018-09-29 09:00:03 来源：文档文库

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番茄果实RNA提取方法比较

　　摘要从富含多糖、多酚的番茄果实中提取高质量的总RNA，对进行下一步分子生物学研究至关重要。采用CTAB-LiCl法和Trizol法分别对番茄果实的总RNA进行提取和分析。结果表明，CTAB-LiCl法提取的总RNA产量低，而且有基因组DNA的污染；Trizol方法提取的RNA产量相对较高，很少有基因组DNA污染。

　　关键词番茄果实；RNA提取；Trizol法；CTAB-LiCl法

　　中图分类号S641.2；Q522.03文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）03-0016-01

　　成熟番茄果实中富含番茄红素，是人们摄取类胡萝卜素的重要来源[1]。番茄中果实RNA的提取对于番茄果实发育特异表达基因的研究有重要意义。同一植物材料中不同组织的RNA提取效果有明显差异，尤其番茄果实中富含多糖、蛋白质、多酚类物质等，一般的试验方法不能满足试验的要求[2]，因此本文用2种不同的方法来提取成熟番茄果实的总RNA，比较其提取结果，以选择适合进行下游分子生物学研究的RNA提取方法。

　　1材料与方法

　　1.1 供试材料

　　供试材料为成熟番茄果实。RNA提取时所用的试验器材和药品均为RNase-Free。

　　1.2提取方法

　　1.2.1Trizol法。取1 g新鲜组织，在液氮中充分研磨成粉末状，加入1 mL的RNAisoReagent匀浆，室温静置5 min；加入1/5体积的氯仿，振荡摇匀，室温静置5 min；12 000 g、4 ℃离心15 min；将上清液转移至新的离心管中，加入与上清液等体积的异丙醇混匀，室温静置10 min；12 000 g、4 ℃离心10 min；向沉淀中加入1 mL 75%乙醇清洗；12 000 g、4 ℃离心5 min；弃上清，保留沉淀并干燥；加DEPC-H2O溶解沉淀。

　　1.2.2CTAB-LiCl法。取1 g新鲜组织，在液氮中充分研磨成粉末状，将磨好的粉末迅速转移至65 ℃预热的含有700 μL CTAB提取液的离心管中，立即涡旋振荡，使其混匀；置于65 ℃水浴中20 min，5 min混匀1次；待冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇，涡旋振荡，4 ℃、12 000 r/min离心10 min；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋振荡，4 ℃、12 000 r/min离心15 min；将上清转移到一新的离心管中，加入1/3体积的8 moL/L LiCl，使其终浓度为2 moL/L，4 ℃沉淀2 h以上；4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清；用75%乙醇洗沉淀，室温晾干，加DEPC-H2O溶解沉淀。

　　2结果与分析

　　2.1番茄果实总RNA的提取

　　将2种方法提取的番茄果实总RNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳，由图1可知，CTAB-LiCl法提取的RNA（样1~3）在点样孔下方均有明显的亮带，说明该方法提取的RNA有较多的基因组DNA污染；28S rRNA的亮度不到18S rRNA的2倍，说明RNA降解程度较大；5S rRNA条带较Trizol法明显，而且伴随有其他条带出现。在Trizol提取的RNA中，28S rRNA和18S rRNA条带清晰，28S rRNA的亮度基本为18S rRNA的2倍，表明提取的RNA很少降解；样5、样6基本无基因组DNA污染，样4中有DNA污染。2种方法都需要进一步在Dnase的处理下得到纯的RNA。

　　2.2cDNA的合成及完整性检测

　　将2种方法提取的RNA反转录成cDNA作为模板，并在番茄actin引物的作用下进行PCR反应，结果见图2。由图2可知，同条件下Trizol法提取的RNA actin条带（样2）较CTAB-LiCl法提取的RNA actin条带（样1）亮且清晰，可以满足RT-PCR的需要。

　　3结论与讨论

　　植物成熟组织中RNA的提取有一定的难度，组织中杂蛋白的去除等都对RNA的得率和质量有一定的影响[3]。在进行cDNA文库建立及后续分子生物学试验研究中，高质量RNA的获得非常重要。番茄果实在成熟后，次级代谢产物增多，在研磨后果实内的酚类物质很容易被氧化，并能与RNA稳定结合影响RNA的提取[4]，要得到高质量的RNA有一定的难度。

　　本试验比较了2种番茄果实总RNA的提取方法效果，CTAB-LiCl提取法简便，操作简单，但操作时间长，总RNA的得率不高且降解度很大，不利于下一步试验的进行；Trizol提取法可在常温下操作，方法简便，花费时间短，从总RNA得率和提取质量上看，能够满足大部分下游操作的要求，但试剂的价格相对偏高。在试验操作过程中所有的验器材都要经过严格的处理，这2种方法都有一定的DNA污染，仍需对Trizol提取法进行一定的改进[5-6]，从而得到纯度更高、无基因组DNA污染的RNA。