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核酸的提取及纯化

发布时间：2023-10-05 08:33:48 来源：文档文库

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核酸的提取与纯化
一DNA的提取与纯化
（一）实验目的与主要原理
DNA存在于细胞核中。通过裂解组织与细胞，使细胞膜破碎，暴露出DNA与蛋白质的混合物。此时，通过蛋白酶的消化，使DNA与蛋白质进行分离，而后利用硅胶柱或者酚：氯仿法，去除蛋白质，从而提取高纯度DNA。（二）实验材料
蛋白质K（20mg/ml）,裂解液（100mmol/lTris(pH8.0,500mmol/LEDTA(pH8.0,20mmol/lNaCl,10%SDS）,硅胶柱，TE（10mmol/lTris-HCl,1mmol/LEDTA(pH8.0,0.5*TAE(20mmol/lTris-乙酸，0.5mmol/lEDTA,pH8.0,10*Loadingbuffer(50mmol/lEDTA,60%甘油，0.25%溴酚蓝，pH7.0。（三）实验方法
DNA提取的方法目前主要有两种，一种是利用酚：氯仿抽提的方法，另一种是利用硅胶柱吸附的方法。其中酚：氯仿抽提法由于试剂具有较强的腐蚀性和毒性，且对环境污染较大,目前使用者较少。而硅胶柱的方法操作比较简单，且毒性很低，对环境的影响较少，故而被广大实验者所使用。目前硅胶柱的生产厂家较多，以沉淀方法较为多见，主要步骤如下。
1样本前处理
哺乳动物细胞：提前准备55℃冰浴。
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（1）对于贴壁细胞，用胰蛋白酶或其他方法收集细胞，对于悬浮细胞，直接收集细胞。用PBS洗3次。
（2）加入3倍体积的裂解液，加入蛋白液K终浓度达到500ug/ml，37℃孵育4~6小时。动物组织：提前准备55℃，70℃水浴。
（1）将25mg动物组织切碎，置于一无菌的1.5ml离心管中（注意，尽量越碎越好）。
（2）加入150~200ul的裂解液（含500ug/ml的蛋白酶K），55℃孵育直至完全裂解，（因组织不同而异，鼠尾6~8h,可以过夜裂解，每小时颠倒2~3次）。
（3）如果需要去除RNA，可以加入适量RnaseA于样品中，室温孵育2min。
（4）12000r离心5min，转移上清于一无菌的离心管。2DNA提取过程
（1）利用2倍体积无水乙醇和1/10体积的3mmol/L醋酸钠沉淀DNA（注意沉淀为DNA，不能弃去）
（2）将上述混合物加入硅胶柱中，12000r离心1min，后用75%的乙醇清洗杂质，洗2~3次。
（3）将硅胶吸附柱置于干净的离心管中，在柱的中央加入200ul预热TE（60℃），或去离子水（pH）7.0），室温静置1min，12000r离心1min，洗脱ＤＮＡ。洗脱出的ＤＮＡ置于－２０℃保存。
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本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/debaf66bef630b1c59eef8c75fbfc77da26997c9.html