[学习目标] 1.说出基因工程的基本操作程序。 2.理解获取目的基因的途径。3.说出基因表达载体的构建的目的与组成。
方式一 抑制疾病传播的转基因蚊子
巴西等拉美国家深受致倦库蚊的危害。致倦库蚊可携带多种病毒和寄生虫，能够传播脑炎、丝虫等传染病，而这些传染病常年在拉美国家肆虐。为了抑制疾病的传播，巴西科学家培育出了一种转基因雄性致倦库蚊。科学家在雄性致倦库蚊体内植入一种特殊基因，当具该基因的转基因雄蚊与野生雌蚊交配时，这种基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡，从而减少了该种蚊子的数量，达到抑制疾病传播的目的。怎样才能最终得到转基因雄蚊呢？让我们一起来学习基因工程的基本操作程序吧！
方式二 师：出示我国有知识产权的转基因抗虫棉的培育图解：
问：转基因抗虫棉的培育需要哪些步骤？
学生看图并回答：首先要获得目的基因，其次将目的基因连接到Ti质粒上，然后将重组的Ti质粒导入受体细胞，最后要重建转基因植物。
根据学生回答补充：还需检测抗虫基因是否已经进入棉花植株，并由此引出基因工程的四部曲。
一、目的基因的获取
1．基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的获取。
(2)基因表达载体的构建。
(3)将目的基因导入受体细胞。
(4)目的基因的检测与鉴定。
2．目的基因的获取
(1)目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
(2)常见方法
①从基因文库中获取
a．基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
b．种类
c．提取依据：基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性。
②利用PCR技术扩增目的基因
a．PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
b．目的：短时间内大量扩增目的基因。
c．原理：DNA双链复制。
d．前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。
e．过程
第一步：加热至90～95 ℃，DNA解链为单链；
第二步：冷却至55～60 ℃，引物结合到互补DNA链；
第三步：加热至70～75 ℃，热稳定DNA聚合酶(Taq酶)从引物起始进行互补链的合成。
如此重复循环多次。
f．结果：每一次循环后，目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)。
③化学方法直接人工合成
a．条件：基因比较小，核苷酸序列又已知。
b．方法：借助DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
归纳总结
1.PCR技术与细胞内DNA复制的比较
2.获取目的基因的方法比较
3.获取目的基因的方法选择
(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中获取目的基因。
(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以通过DNA合成仪利用化学方法直接人工合成。
(3)如果知道要扩增的目的基因及两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，可以通过PCR技术扩增目的基因。
例1
以下为形成cDNA(图中的单链DNA)过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法正确的是( )
A．催化①过程的酶是RNA聚合酶
B．④过程发生的变化是引物与单链DNA结合
C．催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高温
D．如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则一个双链DNA中，A与U之和也占该DNA碱基含量的40%
答案 B
解析 由题意可知，①②③④⑤分别表示反转录、DNA的复制、DNA解链、引物结合到互补DNA链及互补链的合成，B正确；①过程由反转录酶催化完成，A错误；催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，过程⑤是在70～75 ℃的高温条件下进行的，只有该过程中的酶需耐高温，C错误；在DNA分子中有碱基T无U，D错误。
例2
(2017·湖南长沙一中期末考试)下列有关获取目的基因的方法，叙述错误的是( )
A.从基因文库中直接获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性
B.由于真核细胞的基因中含有不表达的DNA片段，所以一般使用人工合成的方法获取真核细胞中的目的基因
C.如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以利用化学方法直接人工合成
D.PCR技术的原理是DNA复制，需DNA连接酶催化DNA合成
答案 D
解析 PCR技术的原理是DNA分子的复制，需要耐高温的DNA聚合酶催化DNA合成，D错误。
二、基因表达载体的构建
1．基因表达载体构建的目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成
3．基因表达载体的构建过程
一般用同一种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接(如图)。
归纳总结
1．启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别
2.构建基因表达载体时限制酶的选择原因分析
(1)选用同一种限制酶切割目的基因和载体的原因：选用同一种限制酶切割会产生相同的黏性末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。
(2)基因工程操作时往往用两种限制酶分别切割目的基因的两端以及载体的原因：①如果用一种限制酶切割，目的基因两侧的末端以及质粒切口的两个末端都是互补的，因此连接时可能会出现载体与载体、目的基因与目的基因、目的基因与载体三种连接情况，而符合要求的只有载体与目的基因的连接。②如果用两种不同的限制酶进行切割就可以有效避免载体与载体以及目的基因与目的基因的连接，提高连接的有效性。
例3
(2017·河南南阳一中月考)在基因工程的操作过程中，获得重组质粒不需要( )
①DNA连接酶 ②限制性核酸内切酶 ③RNA聚合酶 ④具有标记基因的质粒 ⑤目的基因 ⑥四种脱氧核苷酸
A．③⑥ B．②④ C．①⑤ D．①②④
答案 A
解析 构建重组质粒时，首先要用限制性核酸内切酶切割含有目的基因的DNA片段和载体，其次需要用DNA连接酶将目的基因与载体连接；RNA聚合酶催化转录过程，获得重组质粒时不需要RNA聚合酶；获得重组质粒时，需要具有标记基因的质粒作为载体；重组质粒是由目的基因与质粒形成的；四种脱氧核苷酸是合成DNA的原料，获得重组质粒不需要四种脱氧核苷酸。
例4
如图是利用基因工程技术培育转基因植物生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。下列说法错误的是( )
A．图示过程是基因工程的核心步骤
B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
答案 B
解析 图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤；构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ；抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞；基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等。
1．基因工程的核心是( )
A．目的基因的获取
B．基因表达载体的构建
C．将目的基因导入受体细胞
D．目的基因的检测与鉴定
答案 B
解析 目的基因构建表达载体后才能使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能发挥作用，只有构建表达载体后，才能根据载体上的标记基因鉴别目的基因是否导入了受体细胞，从而筛选出含目的基因的受体细胞，避免进行盲目的无效工作。
2．如图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列相关叙述中正确的是( )
A．三种方法都需要酶并均在体外进行
B．①②③碱基对的排列顺序均相同
C．三种方法均属于人工合成法
D．方法a不遵循中心法则
答案 A
解析 这三种方法都是在体外进行的，且都用到酶(方法a需要反转录酶和DNA聚合酶；方法b需要限制酶；方法c需要DNA聚合酶)，A正确；通过方法a得到的目的基因不含有内含子，通过方法c得到的目的基因的碱基序列可能有多种，因此①②③碱基对的排列顺序不都相同，B错误；方法a和c属于人工合成法，而方法b是从供体细胞的DNA中直接分离目的基因的方法，C错误；方法a遵循中心法则，D错误。
3．如图为基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是 ( )
A．氨苄青霉素抗性基因 B．启动子
C．限制酶 D．DNA连接酶
答案 B
解析 启动子是该表达载体所必需的，功能是启动插入基因的转录过程。
4．下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是( )
A．切割含抗虫基因的DNA片段和载体必须用同一种限制酶
B．抗虫基因表达载体中要有启动子和终止密码子
C．抗虫基因表达载体必须具备标记基因，其作用是筛选含有目的基因的受体细胞
D．抗虫基因的表达启动于复制原点
答案 C
解析 切割含抗虫基因的DNA片段和载体可以用不同的限制酶，只要切割出的末端相同即可，A项错误；抗虫基因表达载体的构建必须具备启动子和终止子，终止密码子位于mRNA上，B项错误；基因表达载体必须具备标记基因，其作用是检测目的基因是否导入到受体细胞中，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来，C项正确；抗虫基因的表达开始于启动子，D项错误。
5．重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景。如图是利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中引物2、引物3)分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得目的基因。结合所学知识，回答下列问题：
(1)引物中G＋C的含量影响着引物与模板DNA结合的稳定性，引物中G＋C的含量越高，结合稳定性______________。
(2)在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中，必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为_________________________________。
(3)在引物1、引物2组成的反应系统中，经第一阶段形成图示双链DNA至少要经过__________次复制。
(4)若在引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均复制一次，共产生________种双链DNA分子。
(5)若利用微生物扩增该目的基因，其基本步骤包括：______________、______________、微生物的筛选和培养、从菌群中获取目的基因。
答案 (1)越高 (2)引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用 (3)2 (4)3 (5)目的基因与载体结合 将重组DNA导入受体细胞
解析 (1)由于C与G之间有3个氢键，而A与T之间有2个氢键，所以引物中C与G含量越高，引物与模板DNA的结合就越稳定。
(2)由题干可知，引物2和引物3具有互补配对片段，如果将引物2和引物3放在一个反应系统中，则会引起引物2和引物3的结合而失效。
(3)第一阶段形成的2个DNA分子分别含有引物1和引物2，图中第一阶段形成的DNA分子同时具有引物1和引物2，图示双链DNA分子至少要经过2次复制才能形成。
(4)两个反应系统中各自形成2种DNA分子，但由于引物1和引物4形成两个与原DNA相同的DNA分子，所以含有引物1和4的DNA属于同一种DNA，故共形成3种DNA分子。
(5)利用微生物扩增该目的基因的基本步骤为：①将目的基因与载体结合；②将目的基因导入受体细胞；③微生物的筛选和培养，④从菌群中获取目的基因。
[对点训练]
题组一 目的基因的获取
1．基因工程的基本操作程序有：①使目的基因与载体相结合；②将目的基因导入受体细胞；③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求；④目的基因的获取。正确的操作顺序是( )
A．③②④① B．②④①③
C．④①②③ D．③④①②
答案 C
解析 基因工程的主要操作步骤顺序是：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定。
2．下列获取目的基因的方法中需要模板链的是( )
①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术扩增目的基因 ③反转录法 ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成
A．①②③④ B．①②③
C．①②④ D．②③
答案 D
解析 PCR利用的是DNA双链复制原理，即将双链DNA之间的氢键打开，变成单链DNA ，作为聚合反应的模板。反转录法则是以目的基因转录成的mRNA为模板，在反转录酶的作用下，先反转录形成互补的单链DNA，再合成双链DNA。①、④均不需要模板。
3．(2017·郑州一中高二下学期期中)下列关于基因文库的说法，错误的是( )
A．可分为基因组文库和部分基因文库
B．cDNA文库属于部分基因文库
C．基因组文库的基因在不同物种之间均可进行基因交流
D．同种生物的cDNA文库中基因数量较基因组文库少
答案 C
解析 基因组文库中只有部分基因能够在不同物种之间进行基因交流。
4．下图表示基因工程中目的基因的获取示意图，不正确的是( )
A．③表示PCR技术，用来扩增目的基因
B．从基因文库中要得到所需的目的基因可以根据目的基因的相关信息来获取
C．若获取的目的基因相同，则图中基因组文库小于cDNA文库
D．若基因比较小，核苷酸序列又已知，则可以直接通过人工合成的方法获取
答案 C
解析 可以利用PCR技术，大量扩增目的基因，A项正确；可以根据目的基因的相关信息，如核苷酸序列、基因功能、基因在染色体上的位置等，从基因文库中得到所需的目的基因，B项正确；基因组文库是从DNA中获取的，而cDNA文库是利用mRNA反转录法获得的，不包含内含子，故基因组文库大于cDNA文库，C项错误；若基因比较小，核苷酸序列又已知，则可以直接通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成，D项正确。
题组二 基因表达载体的构建
5．下列哪项不是表达载体所必需的组成成分( )
A．目的基因 B．启动子
C．终止子 D．抗青霉素基因
答案 D
解析 A、B、C三项均为表达载体的必要的组成成分；具有标记基因也是表达载体所必需的组成成分，但抗青霉素基因只是标记基因中的一种，不是所有的表达载体都含有。
6．(2017·无锡模拟)环境雌激素(EEs)会影响动物和人类的性腺发育。斑马鱼在EEs的诱导下，会表达出卵黄蛋白原(vtg)。已知绿色荧光蛋白(GFP)基因能使斑马鱼发光，欲获得能检测水中是否含有EEs的转基因斑马鱼，下列操作合理的是( )
A．将EEs基因的启动子与GFP基因重组
B．将vtg基因的启动子与GFP基因重组
C．将GFP基因的启动子与GFP基因重组
D．将GFP基因的启动子与vtg基因重组
答案 B
解析 由题意可知，环境中的EEs可诱导斑马鱼体内vtg基因的表达，在不含EEs的环境中，斑马鱼体内vtg基因不能表达。因此，只要将vtg基因的启动子与GFP基因重组并导入斑马鱼体内，便能根据斑马鱼是否发光检测水中是否含EEs。
7．下图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法，错误的是( )
A．基因表达载体的构建是在生物体外完成的
B．任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别
C．图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位
D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因
答案 B
解析 由于受体细胞有植物、动物和微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方式不同，所以基因表达载体的构建也会有所差别，不可能千篇一律。
8．在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是( )
①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子 ②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA ③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止 ④所有基因表达载体的构建是完全相同的
A．②③ B．①④
C．①② D．③④
答案 B
解析 基因表达载体的结构包括目的基因、标记基因、启动子、终止子，①错误；有了启动子才能驱动基因转录出mRNA，②正确；终止子的作用是使转录在所需要的地方停止，③正确；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，④错误。
[综合强化]
9．“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有几个( )
A．8 B．6 C．4 D．2
答案 A
解析 由图分析可知：X基因第一次复制得到两个两种DNA分子：①和②；X基因第二次复制得到四个四种DNA分子：①复制得①和③、②复制得②和④；X基因第三次复制得到八个五种DNA分子：①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和④、④复制得④和⑤；X基因第四次复制得到16个五种DNA分子：①复制得①和③、两个③复制得两个③和两个⑤、两个④复制得两个④和两个⑤、两个⑤得到4个⑤。从上面的推测可知，第四轮循环产物中有8个⑤。
10．下列对基因表达载体构建的叙述，不正确的是( )
A．需要限制酶和DNA连接酶等特殊工具
B．基因表达载体中有的含有启动子和密码子
C．标记基因不一定是抗生素抗性基因
D．基因表达载体的构建是基因工程的核心
答案 B
解析 基因表达载体是目的基因与载体的结合，在此过程中需用同一种限制酶切割目的基因与载体，用DNA连接酶将相同的末端连接起来，A项正确；基因表达载体含有启动子、终止子、标记基因和目的基因，密码子位于mRNA上，B项错误；抗生素抗性基因可作为标记基因，但标记基因不都是抗生素抗性基因，C项正确；基因表达载体的构建是基因工程的核心，在细胞外进行，使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用，D项正确。
11．为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。据图回答下列问题：
(1)B过程需要的酶是____________。
(2)图中基因组文库________(填“小于”“大于”或“等于”)cDNA文库。
(3)目的基因Ⅰ和Ⅱ除可从构建的文库中分离外，还可以分别以图中________和________为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是____________。
答案 (1)反转录酶 (2)大于 (3)DNA cDNA
耐高温
解析 B过程是以RNA为模板合成DNA的反转录过程，需要的酶是反转录酶；目的基因Ⅰ和Ⅱ除可从构建的文库中分离外，还可以分别以图中DNA和cDNA为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是耐高温。
12．(2017·吉林舒兰一高高二下月考)识图作答：
(1)PCR技术的中文名称为__________________，加热使DNA双链打开，这一步是打开氢键，在细胞中是在____________酶的作用下进行的。
(2)当温度降低时，引物与模板末端结合，在__________酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成2个DNA分子，此过程中的原料是__________，遵循的原则是______________。
(3)PCR技术的前提是_________________________________________________。“PCR”技术使DNA分子大量复制，若将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制4次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子的比例为__________。在基因工程中，把选出的目的基因(共2 000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是860个)放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是________，其中在第四代利用的胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是__________。
答案 (1)多聚酶链式反应 解旋
(2)Taq 4种脱氧核苷酸 碱基互补配对原则
(3)要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物 17 100 9 120
解析 (1)PCR是多聚酶链式反应的缩写。加热使DNA双链打开，这一步是打开氢键，在细胞中是在解旋酶的作用下进行的。
(2)当温度降低时，引物与模板末端结合，在Taq酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成2个DNA分子，此过程中的原料是4种脱氧核苷酸，遵循的原则是碱基互补配对原则。
(3)利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。PCR技术使DNA分子大量复制，若将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制4次之后，总DNA数达到24＝16个，其中含15N的DNA是2个，所以15N标记的DNA分子占全部DNA分子的比例为＝
。根据题意可知：A＝T＝860，总碱基数是4 000，所以G＝C＝1 140，那么扩增4代，需要提供的胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是1 140×(24－1)＝17 100个。其中在第四代共产生8个DNA，所以在该过程中利用的胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是1 140×8＝9 120个。
13．(2016·全国丙，40)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示，这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有____________，不能表达的原因是_________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有____________和____________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是___________________________________。
答案 (1)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲、丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录 (3)E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
解析 (1)由于限制性核酸内切酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割后形成的黏性末端相同，所以经BamHⅠ酶切得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达。图中甲、丙均不符合，所以不能表达目的基因的产物。(3)常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶。
本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/ba4280d4c4da50e2524de518964bcf84b9d52d8e.html
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