细菌分离培养

试验一 细菌分离培养

试验目的：1、掌握培养基的原理、分类及配置方法。

2、熟悉无菌操作技术、细菌标本的分离、纯化接种方法

3、熟悉细菌培养所用的基本仪器及使用方法。

试验仪器：生物安全柜、电热恒温培养箱、电冰箱、低温冰箱、蒸汽高压消毒器、超净工作台、电子天平、普通光学显微镜、鼓风干燥箱，电磁炉，微波炉等

试验材料：

1、 菌种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌（阴性、阳性各一）。

2、 培养基：普通琼脂培养基（斜面、平板）。

试验步骤：

1、绪论录象（约30分钟）

2、宣读微生物实验室规则

3、细菌接种：

①平板倾注，每人倾注一个平板；

②平板划线，四区划线，分离单个菌落。

③细菌斜面接种。

4、结果报告

5、讨论

讲述：

一、细菌的人工培养　　

微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到许多外界因素的影响，如营养物浓度、温度、水分、气体环境、pH等。微生物的种类不同，培养的方式和所需要的条件也不尽相同。

（一）影响微生物生长的因素

微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到外界许多因素的影响。影响微生物生长的因素很多，简要介绍如下。

1) 营养物质

细菌所需要的营养浓度非常之低，所以在自然界中，它们到处生长，可谓是无孔不入。然而营养太低时，细菌生长就会遇到困难，甚至还会死亡。故有的营养要求相对较高的细菌，培养时需加相应的营养物质，以维持其生长需要。

２）温度

　　在一定的温度范围内，每种微生物都有自已的生长温度三基点：最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度。在生长温度三基点内，微生物都能生长，但生长速率不一样。微生物只有处于最适生长温度时，生长速度才最快，待时最短。超过最低生长温度，微生物不会生长，温度太低，甚至会死亡。超过最高生长温度，微生物也要停止生长，温度过高。也会死亡。一般情况下，每种微生物的生长温度三基点是恒定的。但也常受其它环境条件的影响而发生变化。

　　根据微生物最适生长温度的不同，可将它们分为三个类型：

　　a.嗜冷微生物：其是适生长温度多数在- 10℃－20℃之间

　　b.中温微生物：其最适生长温度一般在20℃－45℃之间

　　c.嗜热微生物：生长温度在45℃以上。

３）湿度

　　水分是微生物进行生长的必要条件。芽孢、孢子萌发，首先需要水分。微生物是不能脱离水而生存的。但是微生物只能在水溶液中生长，而不能生活在纯水中。各种微生物在不能生长发育的水分活性范围内，均具有狭小的适当的水分活性区域。

４）气体

　A 氧气　按照微生物对氧气的需要情况，可将它们分为以下五个类型。

　　a.需氧微生物

　　这类微生物需要氧气供呼吸之用。没有氧气，便不能生长，但是高浓度的氧气对需氧微生物也是有毒的。很多需氧微生物不能在氧气浓度大于大气中氧气浓度的条件下生长。绝大多数微生物都属于这个类型。

　　b.兼性需氧微生物

　　这类微生物在有氧气存在或无氧气存在情况下，都能生长，只不过所进行的代谢途径不同罢了。在无氧气存在的条件下，它进行发酵作用，例如酵母菌的无氧乙醇发酵。

　　c.微量需氧微生物

　　这类菌是需要氧气的，但只在0.2大气压下生长最好。这可能是由一它们含有在强氧化条件下失活的酶，因而只有在低压下作用。

　　d.耐氧微生物

　　这类微生物在生长过程中，不需要氧气，但也不怕氧气存在，不会被氧气所杀死。

　　c.厌氧微生物

　　这类微生物在生长过程中，不需要分子氧。分子氧存在对它们生长产生毒害，不是被抑制，就是被杀死。

B其他气体： 有的细菌生长需要氮气、二氧化碳等气体

物理因素：如射线----日光、紫外线、声波；

5）其他因素： 化学因素：Ph、消毒剂、防腐剂等

生物因素：抗生素、细菌素、噬菌体等

（二）培养基

营养成分：水、氮源、碳源、无机盐、生长因子

1、培养基的主要成分 凝固物质：琼脂、明胶、卵蛋白及血清等

抑制剂：加入某些化学物质（如抗生素等药物），

抑制某些非目的菌生长，有利于目的菌的生长

按用途作用：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基、厌氧培养基

2、培养基的分类 按固型成分：固体培养基（2-3%） 平板、斜面

半固体培养基（0.25-0.3%）

液体培养基

按工艺： 天然培养基、人工培养基

3、培养基的制作过程：配料---溶解---调pH---过滤---分装---高压灭菌---（必要时要做检菌试验）备用

（三）、培养方法

根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养和厌氧培养两大类。

1、需氧培养：也称“ 好气培养”。就是说这种微生物在培养时，需要有氧气加入，否则就不能生长良好。在实验室中，斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气。三角烧瓶液体培养多数是通过摇床振荡，使外界的空气源源不断地进入瓶中。

2、二氧化碳培养：某些细菌（如布鲁菌、脑膜炎奈瑟菌等）须在一定浓度的二氧化碳环境中才能生长；常用烛缸法、化学法、二氧化碳培养箱

3、厌氧培养：也称“ 厌气培养”。这类微生物在培养时，不需要氧气参加。在厌氧微生物的培养过程中，最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。

常用：疱肉法、焦性没食子酸法、硫乙醇酸钠法、气袋法、厌氧罐法、厌氧箱培养法

4、微需氧培养法：有些微需氧菌（如幽门螺旋菌等）在低氧压的条件下生长良好，可用抽气换气法充5%氧气、10%二氧化碳、85%氮气于培养罐中，37度培养。

（四）接种方法选择

含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixed culture）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure culture）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化。

平板的用途：

①供分离划线；分离划线的目的是为了得到单个菌落，以备进一步鉴定；

②扩大培养，得到更多的菌苔。

斜面的用途：

①斜面培养一般用于保存菌种。

②纯培养以得到更多菌苔，用于鉴定 。

无菌操作

培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。

二、示教：

1、接种环的制作及使用：接种环的拿法及注意事项；

　接种和分离工具

1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀

2、平板的倾注方法；琼脂量约占平板深度的1/3-1/2为宜。

3、细菌平板四区或三区划线方法：平板的拿法，划线时手法要轻、密，但不能重叠。

平板培养基接种的分离培养法

4、 斜面接种方法:蛇形划线。

注意事项：

1、倾注平板时，皿盖要半开，留有通气孔，待琼脂凝固后立即盖上皿盖，翻转放置，以防蒸馏水流淌到培养基上，影响培养结果。（平板表面有水，影响分离；蒸馏水由抑制细菌生长作用）

2、先做标记后操作，试管标记在管壁上，平板标记在皿底上。

3、平板划线时要尽可能轻且密，切忌用力过重划破琼脂和重复划线，失去分离意义。

4、斜面蛇形划线，可反复重复划。

5、培养时，试管要站立培养，以防长生蒸馏水影响结果；而平板要倒扣既皿底朝上培养，防污染。

报告要求：

1、 准备一个本子，一定要有封皮，本皮写上课程名称、专业、年级、姓名及学号

2、 每个试验报告要另起一页，要有题目、目的、材料、步骤、结果及讨论，缺一不可。

3、 值日生要严格履行职责，认真清扫，关好水、点、门窗，离开实验室前要吿知带教老师。

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/b5b1ca35541810a6f524ccbff121dd36a22dc4ce.html