过氧化物酶活性的测定

园艺学院设施201402 李密

实验三

（一）过氧化物酶活性的测定（愈创木酚法）

一、实验目的

通过实验掌握提取POD和测定其活性的方法和原理。

二、实验原理

以愈创木酚为底物，在过氧化物酶（POD）催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470 nm波长处有最大光吸收值，故可通过测470 nm波长下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。

三、材料、设备和原理

1. 材料马铃薯块茎

2. 设备光光度计、离心机、天平、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸管

3. 试剂已配置好的反应混合液、20m mol/LKH2PO4、100m mol/L磷酸缓冲液

四、 操作方法

1.酶液制备

2．比色测定

五、实验结果

10分钟内测定的酶液吸光度

计算：

酶活力（0.01A470/min）

245.0

酶的比活力（μ/g）

六、讨论

1、由于仪器较少,等待测POD值的时间较长,且没有放在低温下保持。导致酶活性的测定结果出现一定的偏差。

2、理论上POD值与时间的关系曲线应为抛物线，但实际测出来的曲线大体为线性关系。可能原因有 ①把酶液加入到3ml反应混合液时，反应太快，待到1min读取POD值时，反应已经过了指数增长期，处于缓慢增长状态。离心出来的酶液在室温下放置时间过长。

（二）可溶性蛋白质含量的测定（考马斯蓝G-250法）

一、实验目的

掌握测量可溶性蛋白的方法及其原理。

二、实验原理

可溶性蛋白质与考马斯蓝G-250反应生成青色产物，在595nm波长有最大吸收峰，其颜色深浅与可溶性蛋白含量成正相关，可用分光光度法测定可溶性蛋白的含量。

三、材料、设备和原理

1.材料马铃薯提取液

2.设备分光光度计、10ml刻度试管、移液管

3.试剂考马斯蓝G-250、100μg/ml标准蛋白液

四、操作方法

1. 标准曲线制作

2. 样品液测定

五、实验结果

标准蛋白液的吸光度值

计算：

实验测得马铃薯提取液的吸光度值为0.106

由Y=0.0059x得

x=0.106/0.0059

=17.97μg/ml

蛋白含量×

六、讨论

1、如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。

2、测定中，蛋白-染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上，不可使用石英比色皿（因不易洗去染色）。可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95% 的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

3、其他的测定蛋白质的方法，与考纳斯蓝比色法比较存在的优缺点。

目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。

考马斯亮蓝法的突出优点是：

（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1g。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。

（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/a1dc34f052ea551811a687c5.html