（推荐）霉菌酵母菌检验

检 验 原 始 记 录

编号：

报告类别：

微生物

共 页

项目：

霉菌mould 酵母菌yeast

检验地点：

样品名称：

样品编号：

样品状态：

符合检验要求； 其他

环境条件：

实验依据及步骤

GB4789.15-2016

样品稀释

固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225ml生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌均质容器内均质，或放入盛有225ml稀释液的无菌均质袋中拍击式均质器拍打，制成为1:10样品匀液。依次进行10倍递增稀释。

液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml无菌稀释液（蒸馏水或磷酸盐缓冲液或生理盐水）的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中混匀，为1:10样品匀液。

用灭菌吸量管吸取1∶10稀释液10mL，注入试管中，另用带橡皮乳头的1mL灭菌吸量管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。

取1mL1∶10稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换一支1mL灭菌吸量管吹吸5次，此液为1∶100稀释液。

按上述操作顺序做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1mL灭菌吸量管。

液体样品：直接吸取样品原液进行检验。

倾注平板

选择2-3个适宜稀释度样液，各吸取1ml分别加到两个平皿内，同时分别吸取1ml空白稀释液加入两个平皿作空白对照。及时用适量（20~25ml）46±1℃的马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红琼脂倾注平皿，转动平皿混合均匀。

琼脂凝固，正置平板。

培养

样品28℃±1℃培养

培养起止时间

起：

培养至第五天

止：

数据分析与结果

一、菌落计数

1） 选取菌落数在10CFU~150CFU之间，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母菌。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为菌落蔓延。

2）计算同一稀释度的两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数。

3）所有稀释度菌落计数都不在区间

如均大于150CFU，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

如均小于10CFU，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。

如菌落数有的大于150CFU，有的又小于10CFU，但均不在10~150CFU之间，则应以最接近150CFU或10CFU的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

如所有稀释度（包括液体样品原液）均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告。

4）若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

5）作平皿内菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。

二、平皿菌落总数计算CFU/g（ml）

（1） 若有两个连续稀释度的平板菌落总数在适宜计数范围（10CFU~150CFU）内时，按式（Ⅰ）计算：

N= ∑C/(n1+0.1n2)d ………………（Ⅰ）

式中： N——样品中菌落总数；

∑C——平板（含适宜范围菌落总数的平板）菌落数之和；

n1——第一个适宜稀释度平板数；

n2——第二个适宜稀释度平板数；

d——稀释因子（第一稀释度）

（2） 按“四舍五入”原则，以整数报告。

菌落数在10以内时，采用第一位有效数字报告；

菌落数在10~100之间时，采用两位有效数字报告。

（3） 如大于或等于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。

（4） 称重检样以克CFU/g为单位报告，体积取样以毫升CFU/ml为单位报告

三、霉菌直接镜检计数法

（1） 流程

取样→称样→稀释→调节视野→涂片→观察→记录→计算 4步骤

（2） 检样制备

取定量检样，加蒸馏水稀释至折光指数为1.344～1.3460（即浓度为7.9～8.8％）。用糖度计或折光仪测定折光指数或浓度，如果折光指数过大或过小，须加水或样品，直至配成标准样液，才能进行检验。

（3） 标准视野的调节

霉菌计测用的显微镜，要求物镜放大倍数为90～125倍，其视野直径的实际长度为1.382mm，则该视野为标准视野。

检查标准视野：将载玻片放在载物台上，配片置于目镜的光栏孔上，然后观察。标准视野要具备两个条件：载玻片上相距1.382mm的两条平行线与视野相切；配片（测微器）的大方格四边也与视野相切。如果发现上述两个条件，其中有一条不符合，须经校正后再使用。

（4） 涂片

检查玻片

首先用擦镜纸或绸布沾酒精将载玻片和盖玻片擦净。检查是否擦干净，可将盖盖玻片置于载玻片的两条突肩上观察盖玻片与载玻片突肩的接触处是否产生牛顿环，如果没有产生牛顿环，表明没有擦净，必须重新擦，直至产生牛顿环，方可使用。

（5） 加样

用滴管或玻棒取一大滴混合均匀的样液，均匀地摊布于载玻片中央的平坦面上，盖上盖玻片（盖玻片可直接盖上去，也可以从突肩边沿处吻合切入）。 如果发现样液涂布不均匀、有气泡、或样液流入沟内、从盖玻片与突肩处流出、盖玻片与载玻片的突肩处不产生牛顿环等，应弃去不用，重新制作。

（6）观察记录

观察视野数及分布

对一般样品，每个涂片均检查50个视野，所检查的50个视野要均匀地分布在计测室上，可用显微镜载物台上带有标尺的推进器来控制，从上到下，或从左到右一行行有规律地进行观察。

（7） 记录结果

阳性视野与阴性视野的判断：在标准视野下，上下调节焦距发现有霉菌菌丝，其长度超过标准视野直径（1.382mm）的1/6（即一个小方格的边长）或三根菌丝总长度超过标准视野直径的1/6，这个视野称为阳性视野，否则称为阴性视野。

有时在标准视野中出现极细的菌丝丛或小菌落，则以其直径来计算，超过视野直径1/6为阳性视野，否则为阴性视野。阳性视野用“＋”表示；阴性视野用“－”表示之。

对初次学习菌计测法者，作记录前，先在记录纸上划出计测室上50视野均匀分布的小格，观察一个标准视野，立即在相应的方格内作“＋”或“－”的记录，或“－”以空格表示之。

如果一个样品做两个片子，观察结果误差较大（超过6％），则另取样涂片，观察测定至误差＜6％时为止。

（8） 结果计算

霉菌数，用百分比表示。其含义如下： 将0.15mm3标准样液，均匀地摊布成厚0.1mm，直径为1.382mm，其面积为1.5mm2的标准视野，在显微镜下检查。按100个视野数计算，其中发现有霉菌菌丝存在的视野数（即阳性视野数）。

霉菌数（％）＝ ×100％

举例：记录的阳性视野数，片1为15，片2为16，

则样品的霉菌数为： 样品霉菌数（％）＝ ×1/2×100％＝31％

（9）注意事项

部颁标准为阳性视野不超过40％，在国际贸易中，合同上无要求时按部颁标准执行，合同上有要求时按合同执行;每抽取一罐样品制两个片子，每片观察50个视野，如果超过标准指标，应该继续制片，但片子数量不得少于3片即150个视野，如果计测结果相近时，可取其平均值;如对抽样结果有异议，应加倍抽样。全部合格，作为合格处理，其中有一罐不合格，该批作为不合格处理。

附：

磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钾 34.0g 蒸馏水500ml （稀释液需要1000ml）

贮存液：将34.0g磷酸二氢钾溶于500ml蒸馏水中，用大约175ml的1mol/l氢氧化钠溶液调节ph至7.2，用蒸馏水稀释至1000ml后贮存冰箱。

稀释液： 取贮存液1.25ml用蒸馏水稀释至1000ml分装于适宜容器，121℃高压灭菌15min。

生理盐水：氯化钠 8.5g 蒸馏水1000ml 将称取好的氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121高压灭菌15min。

检测记录：

校对：

检测日期：

产品名称

日期班次

观察结果

日期时间

分析物编号

（稀释度）

平均值

菌落计数

产品名称

日期班次

观察结果

日期时间

分析物编号

（稀释度）

平均值

菌落计数

产品名称

日期班次

观察结果

日期时间

分析物编号

（稀释度）

平均值

菌落计数

产品名称

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观察结果

日期时间

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（稀释度）

平均值

菌落计数

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观察结果

日期时间

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（稀释度）

平均值

菌落计数

产品名称

日期班次

观察结果

日期时间

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（稀释度）

平均值

菌落计数