猪血液中超氧化物歧化酶SOD的提取及活力测定

发布时间：2020-04-04 14:29:14 来源：文档文库

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猪血液中超氧化物歧化酶（SOD）的提取及活力测定

学校青岛农业大学学院生命科学学院

年级专业生物技术1001

姓名毛嘉宁（187********）王颖（187********）

摘要

哺乳类动物血液中存在着大量的生物活性物质 ,如超氧化歧化酶 (Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ,简称ＳＯＤ)、凝血酶等。是生物体内重要的超氧阴离子自由基清除剂，能催化生物体内超氧自由基（O2-）歧化反应，对机体细胞起保护作用，己成为化学及生物化学研究领域中热门的研究课题。ＳＯＤ在临床上有广泛用途 (延缓人体衰老、防止色素沉着、消除局部炎症等 ) ,特别是治疗风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及放射治疗后的炎症。在实验中利用血块采用机械破碎法破膜，采用热变性和乙醇—氯仿沉淀去除杂蛋白，然后用丙酮沉淀得到粗SOD溶液。

关键词：超氧化物歧化酶分离提取猪血

1前言体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内。现已证实，在生物体内，SOD具有抗氧化、解毒等重要作用；在体外，具有抗辐射、抗肿瘤及抗衰老、增强人体免疫等功能，广泛用于医药、食品、化妆品等行业，市场广阔。猪血是SOD的重要来源，我国猪血资源十分丰富，具有独特的加工优势。本实验在加热法的基础上用有机溶剂丙酮沉淀超氧化物歧化酶SOD，将SOD从血液中提取出来。

2实验目的：

2.1了解SOD的生理功能

2.2了解SOD的制备方法

3实验原理：

超氧化物歧化酶(SOD)是一种金属酶，也是一种蛋白质，可在一定浓度的酸、碱、盐溶液中溶解，又可在一定浓度的有机溶剂中沉淀，可以利用这一特点，将SOD从血液中提取出来。

3.1 加入柠檬酸三钠作为抗凝血剂使用，通过离心机离心，从猪血中分离出红细胞。

3.2 利用95%乙醇洗掉DNA，利用氯仿抽提血红蛋白等杂蛋白，再通过离心作用进行离心分离。

3.3 利用热变性原理，在随温度的升高和实验操作时间的延长，酶的活性和杂蛋白的含量均呈下降趋势，从比活性上讲猪血中的SOD在55℃-65℃变性。变性时间为15—26min最适宜，酶纯度最高。

3.4 利丙酮作为有机溶剂除杂，离心去沉淀。

3.5 在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出02-，生成带色的中间产物，反应开始后先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30-45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。

4 实验设备

4.1恒温水浴冰浴器

4.2离心机

4.3布氏漏斗、抽滤瓶、滤纸

4.4烧杯、量筒、玻璃棒

5实验材料及试剂

5.1猪血

5.2 3.8%（质量分数）柠檬酸三钠

5.3 0.9%（质量分数）氯化钠

5.4 95%（体积分数）乙醇

5.5 氯仿

5.6 丙酮

5.7 pH7.6、2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液

5.8 去离子水、蒸馏水

5.9 pH8.2、50mmol/L Tris-HCl

a.称取Tris0.61g，EDTA-2Na0.037g,用双蒸馏水溶解至80ml左右，用HCl调节pH=8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。

5.10 10mmol/L HCl

5.11 50mmol/L 邻苯三酚

a．称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。

6 实验操作步骤

6.1分离血球

取新鲜猪血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心20min，收集红血球。

6.2除血红蛋白

红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入1～1.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后4 000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液。

6.3热变性

上清液加热到65℃，保温10min，然后迅速冷却到室温，3 000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清液。

6.4 沉淀

清液在盐冰浴中冷却，然后在-5℃以下的操作温度下，加入1.5倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，快搅慢加，即有白色沉淀产生，用4 000r/min离心20min，用pH7.6的2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液透析，即得粗SOD溶液。

6.5 邻苯三酚自氧化速率的测定

取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液，然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl 代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。

表1