荧光定量PCR注意事项

发布时间：2018-07-02 00:55:35 来源：文档文库

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荧光定量 PCR 注意事项

一、基本步骤：

1、目的基因的查找和比对；

2、引物设计；

3、引物合成；

4、反应体系的配制；

5、反应条件的设定；

6、反应体系和条件的优化；

7、荧光曲线和数据分析；

8、标准品的制备；

二、技术关键：

1 目的基因（DNA 和 mRNA）的查找和比对

从 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网点的 genbank 中下载所需要的序列。下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后，再打开 DNAstar 软件中的 Editseq 软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。另一种直接用 DNAstar 软件中的 Editseq 软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后要对所有的序列进行排序。用 DNAstar 软件中的 Seqman 软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq” 的所有文件，点击“add” 或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble” 进行比较。横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。有时要设定比较序列的开始与结尾。有时因为参数设置的原因，可能分为几组 (contig) ，若想全部放在一组中进行比较，就调整 “project” 菜单下的 “parameter” ，在 “assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为 80，可调低即可。再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。有时因此个别序列原因，会出现重复序列，碱基的缺失或插入，要对“contig”的序列的排列进行修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后，点击“save”保存即可。分析时，主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不可用的。

2 引物设计

细心地进行引物设计是 PCR 中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：

a) 序列选取应在基因的保守区段；

b) 扩增片段长度根据技术的不同有所分别： SYBR GREEN I 技术对片段长度没有特殊要求； Taqman 探针技术要求片段长度在 50bp－150bp；

c) 避免引物自身或与引物之间形成 4 个或 4 个以上连续配对；

d) 避免引物自身形成环状发卡结构；

e) 典型的引物 18 到 24 个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降

f) 低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于 24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。Tm 值在 55－65℃，GC 含量在 40%－60%；

g) 引物之间的 TM 相差避免超过 2℃；引物的 3’端避免使用碱基 A；

h) 引物的 3’端避免出现 3 个或 3 个以上连续相同的碱基。为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。

3 影响 PCR 及荧光 PCR 的其他因素

引物的设计和选择符合荧光 PCR 的探针并进行设计对于实时荧光 PCR 尤其重要。可以说，不合理的设计意味着绝对的失败。但是，好的设计并不等于好的实验结果，影响 PCR 和荧光 PCR 的因素非常多，下面择其重要进行介绍。

3.1 引物退火温度

引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当 50％的引物和互补序列表现为双链 DNA 分子时的温度。Tm 对于设定 PCR 退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从 55℃到 70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm 低 5℃。

设定 Tm 有几种公式。确定引物 Tm 最可信的方法是近邻分析法。大部分计算机程序使用近邻分析法——从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。所有 oligo 软件会自动计算引物的 Tm 值。在设置退火温度时可以如下进行：以低于估算的 Tm5℃作为起始的退火温度，以 2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的 Tm 值。引物对的 Tm 差异如果超过 5℃，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm 不同，将退火温度设定为比最低的 Tm 低 5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高 Tm 设计的退火温度先进行 5 个循环，然后再根据较低 Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

3.2 引物浓度

引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在 0.1 到 0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。为了确定引物浓度，可以在 260nm（OD260）测量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数（nmol/OD），通过 Beers 法则（公式 1）计算引物浓度。微摩消光系数可以使用公式 2 计算。与大分子双链 DNA 可以使用平均消光系数不同，确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。这是因为引物较短，碱基组成差异很大。在 oligo 软件上可以计算出引物的的消光系数（OD/μmol）和消光系数的倒数（μmol/OD）。

一般商业合成的引物以 O.D.值表示量的多少，在一般情况下，20 个碱基长的引物，1 个 O.D.加 100ul 水后引物浓度为 50pmol/ul（50μM）。也可以用 OLIGO 软件，根据引物的的消光系数（OD/μmol），计算出一定的工作浓度下，引物的加水量。

浓度(μM)＝A260（OD/ml）×稀释系数×消光系数的倒数（nmol/OD）

举例：计算某寡核苷酸（溶于 1ml 水中），取其中的 10μl 稀释 100 倍（加入 990μl）水中。在 A260 处测吸光度为 0.2。计算消光系数的倒数为 4.8 nmol/OD，代入得：

浓度＝0.2（OD/ml）×100×4.8（nmol/OD）＝96nmol/ml＝96μM

3.3 热启动

热启动 PCR 是除了好的引物设计之外，提高 PCR 特异性最重要的方法之一。尽管 Taq DNA 聚合酶的最佳延伸温度在 72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行 PCR 反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于 DNA 工程的遗传元件的构建和操作，热启动 PCR 尤为有效。

3.4 镁离子浓度

镁离子影响 PCR 的多个方面，如 DNA 聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP 和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含 200μM dNTP 的实时定量 PCR，使用 3 到 5mM 带有荧光探针的镁离子溶液（普通 PCR 是 1.5mM）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，普通 PCR 从 1mM 到 3mM，以 0.5mM 递增，进行镁离子滴定。为减少对镁离子优化的依赖，可以使用 Transitor® Hot Start Taq 酶。Transitor® Hot Start Taq DNA 聚合酶能够在比一般的 Taq DNA 聚合酶更广的镁离子浓度范围内保持功能，因此仅需较少的优化。

3.5 模板质量

模板的质量会影响产量。DNA 样品中发现有多种污染物会抑制 PCR。一些在标准基因组 DNA 制备中使用的试剂，如 SDS，在浓度低至 0.01％时就会抑制扩增反应。分离基因组 DNA 较新的方法包括了 DNAZol，一种胍去垢剂裂解液，以及 FTA Gene Guard System，其可以同基质结合，在血液及其他生物样品中纯化贮存 DNA。应注意进行 PCR 反应的模板质量，以增加 PCR 反应的成功率。

3.6 模板浓度

起始模板的量对于获得高产量很重要。对大多数 PCR 扩增和荧光 PCR 扩增，104 到 106个起始目的分子就足以观测到好的荧光曲线（或在溴化乙锭染色胶上观察到）。所需的最佳模板量取决于基因组的大小（下表）。举例说，100ng 到 1μg 的人类基因组 DNA，相当于 3×104 到 3×105 个分子，足以检测到单拷贝基因的 PCR 产物。质粒 DNA 比较小，因此加入到 PCR 中的 DNA 的量是 pg 级的。对于一般的检测样品，10－100ng 的量就足够检测了。当然对模板做一个梯度稀释，对于定量 PCR 而言是非常容易，且能分析扩增效率。