(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备
发布时间：2020-05-12 来源：文档文库
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大肠杆菌感受态细胞的制备
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tr..,Ca..,co.. 分类： 细胞技术 > 感受态细胞 来源：
实验管理实验概要
大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化 实验原理
处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl法，RbCl(KCl法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。 主要试剂
(10.1mol/L CaCl2溶液 (2LB液体培养基
(330%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。 主要设备 (1超净工作台 (2冷冻离心机 (3恒温摇床 (4－70℃冰箱 (510mL移液管 (6吸耳球
(71mL、200μL移液枪（配套枪头） (850mL 离心管 (91.5mL离心管 实验材料
(1大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-） 实验步骤
（一）受体菌的培养
(1从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h左右）。
(2将该菌种悬液以1:100的比例接种，取250μL菌液转接到25mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h至OD600＝0.5左右。
（二）感受态细胞的制备（注意：以下操作在超净工作台完成。） (1将菌液转入50mL离心管中，冰上放置10min。
(2在4℃下，4000r/min离心10min。弃去上清，将管倒置1min以便培养液流尽。 (3用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置30min。 (40～4℃ 4000r/min离心10min，弃去上清，加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置（务必冰上放置）。（注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制备）
（三）感受态细胞的分装与冻存
(1在2mL制备好的感受态细胞中加入2mL30%甘油（即1:1体积，甘油终浓度15%）。 (2将此感受态细胞分装成每份200μL (1.5mL dorf管
