Msx2条件性基因敲除小鼠动物模型的建立和表型的初步研究

发布时间:2022-11-28 05:05:13   来源:文档文库   
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Msx2条件性基因敲除小鼠动物模型的建立和表型的初步研究
于紫燕;王春霞;孙琦;赵江月;张劲松
【摘要】目的利用Cre/LoxP系统建立晶状体组织特异性Msx2基因敲除小鼠模,并初步研究其表型.方法设计基因敲除方案,获得条件基因敲除小鼠Msx2cko对照野生型小鼠Msx2wt.通过PCR技术对小鼠或E10.5E14.5胚鼠进行基因型鉴定,通过整胚LacZ染色鉴定Le-Cre重组酶活性,同时通过对P1小鼠晶状体组织HE染色进行初步表型观察.结果通过基因型检测证实了Msx2基因敲除小鼠模型建立成功,LacZ染色显示Le-Cre重组酶特异性表达在发育中的小鼠胚胎形成晶状体板的表面外胚叶特定区域.Msx2ckoP21小鼠表现为小眼球畸形,眼周至鼻线性脱毛.HE染色显示Msx2cko小鼠晶状体体积减小及晶状体茎形成.结论初步建立了Msx2条件性基因敲除小鼠模型,Msx2条件基因敲除后引起小鼠晶状体发育异常,小眼球畸形.
【期刊名称】《中国医科大学学报》【年(,期】2016(045011【总页数】4(P964-967
【关键词】晶状体;条件基因敲除;小鼠;Msx2【作者】于紫燕;王春霞;孙琦;赵江月;张劲松
【作者单位】中国医科大学附属第四医院眼科,中国医科大学眼科医院,辽宁省晶状体学重点实验室,沈阳110005;中国医科大学附属第四医院眼科,中国医科大学眼科医院,辽宁省晶状体学重点实验室,沈阳110005;中国医科大学附属第四医院眼科,国医科大学眼科医院,辽宁省晶状体学重点实验室,沈阳110005;中国医科大学附属

第四医院眼科,中国医科大学眼科医院,辽宁省晶状体学重点实验室,沈阳110005;江大学医院院附属第二医院眼科,杭州310009;中国医科大学附属第四医院眼科,国医科大学眼科医院,辽宁省晶状体学重点实验室,沈阳110005【正文语种】【中图分类】Q954.48网络出版地址
晶状体作为眼屈光间质,具有屈光和调节等重要功能。同时,晶状体在眼组织发育过程中也起着至关重要的作用。由于晶状体接近胚胎表面,易于进行实验操作,所以近1个世纪以来,各国学者对晶状体的发生发育进行了广泛深入的研究。同源盒基因Msxmusclesegmenthomeobox)属于Hox基因家族成员,脊椎动物中已有3Msx基因被识别,均为染色体上不相连续但结构极为相似的成员。Msx2基因位于5号染色体长臂5q34q35,编码由263个氨基酸组成的蛋白质,它可以与核心转录复合物作用调节转录[1]。以往的研究[2]多集中在Msx2对颅骨、乳腺等组织发育的影响上,Doheny眼科研究所LIU等[3]首次发现Msx2是晶状体发育调控因子,过表达或缺失均引起晶状体发育异常、视网膜和视神经发育不全、小眼球畸形。研究[4]发现,Msx2过表达转基因小鼠中,Msx2过表达可抑制视网膜细胞增殖并诱导其凋亡,抑制发育的视泡背侧视网膜骨形态发生蛋白4BMP4)表达,上调BMP7表达;在小鼠晶状体上皮细胞中,Msx2制细胞增殖和分化,触发凋亡[5]。Msx2传统基因敲除小鼠中,E10.5晶状体组织FoxE3mRNA表达下调,Sox2蛋白在晶状体中表达正常,但视网膜组织中其表达下降,Pax6蛋白及Six3蛋白表达正常。
本研究拟应用CreLoxP系统建立Msx2条件性基因敲除小鼠模型,需要2种转基因动物,一种是在靶向敲除基因组序列中引入LoxP序列的Msx2转基因小鼠

6],另一种是通过Pax6启动子驱动的Cre转基因小鼠。在获得全身性携带Msx2条件性等位基因小鼠后,与LeCre转基因小鼠交配,并对子代通过基因型鉴定及LacZ染色进行验证,为后续表型研究奠定基础。1.1实验动物
亲代Msx2flox/flox小鼠(C57BL背景),Msx2flox/floxROSA26LeCre小鼠LeCre小鼠,均由美国南加州大学YiHsinLIU教授赠予。动物饲养于恒温恒湿SPF级房间,喂以标准饲料。1.2小鼠的饲养和繁殖
将亲代Msx2flox/flox小鼠(C57BL/6背景)与Msx2flox/floxROSA26LeCre小鼠杂交,获得基因型Msx2flox/floxROSA26Cre+/-)(敲除型Msx2cko小鼠和Msx2flox/floxROSA26Cre-/-)(野生型Msx2wt)小鼠。以观察到母鼠体内阴道栓为受孕第1天标志计数胚胎时间,选择胚胎发育E10.5E14.5小鼠胚胎待用。在整个模型小鼠繁殖过程中,雄性和雌性小鼠以1∶4的比例合笼交配。实验均采用同笼出生的野生型小鼠和基因敲除小鼠。1.3小鼠子代基因型鉴定
根据打靶载体构建时Flox区域设计的位置,利用PCR方法扩增野生型和敲除型基因片段,并根据基因片段长度或产物的有无判断小鼠的基因型。
1.3.1DNA提取及PCR鉴定基因型:取小鼠尾尖约0.5cm,置于1.5mLEppendorf管中,每管加入鼠尾裂解缓冲液100μL,55℃恒温箱孵育过夜。震荡组织并混匀,85℃加热1h,获取小鼠基因组DNA,保存于4℃待用。
PCR反应引物由南加州大学合成,引物序列见表1PCR反应体系:总计25μL,其中Q反应液5μL,PCR缓冲液2.5μL,dNTP0.5μL,Taq0.125μL,引物1μL,DNA模板1μL,H2O13.875μL。PCR扩增条件:94℃4min;94℃1min,56℃1min,72℃1min,35个循环;72℃10min;4℃保温。

本文来源:https://www.2haoxitong.net/k/doc/ff262bbbd3d233d4b14e852458fb770bf78a3bb7.html

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