紫外分光光度计基本工作原理

发布时间：2019-02-28 18:14:33 来源：文档文库

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紫外分光光度计基本工作原理：

紫外分光光度计基本工作原理和红外光谱仪相似，利用一定频率的紫外可见光照射被分析的有机物质，引起分子中价电子的跃迁，它将有选择地被吸收。一组吸收随波长而变化的光谱，反映了试样的特征。在紫外可见光的范围内，对于一个特定的波长，吸收的程度正比于试样中该成分的浓度，因此测量光谱可以进行定性分析，而且根据吸收与已知浓度的标样的比较，还能进行定量分析。

紫外分光光度计特点和主要用途：

紫外可见光谱仪涉及的波长范围是0.2--0.8微米（对应波数50000-12500厘米-1），它在有机化学研究中得到广泛的应用。通常用作物质鉴定、纯度检查，有机分子结构的研究。在定量方面，可测定结构比较复杂的化合物和混合物中各组分的含量，也可以测定物质的离解常数，络合物的稳定常数，物质分子量鉴别和微量滴定中指示终点以及在高效液相色谱中作检测器等。

分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的光吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。

1. 基本原理

　　单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，即朗伯 - 比尔定律，这是吸收光谱法定量的理论依据，其关系式如式 3-1 ：
A = ECL 式 (3-1)
　　式中 A 为吸收度； E 为吸收系数，即单位浓度、单位液层厚度的吸收度数值； C 为溶液浓度； L 为液层厚度。
　　紫外 - 可见分光光度法是根据物质分子对波长为 200~760nm 这一范围的电磁波的吸收特性所建立的光谱分析方法。《中国药典》 (2005 年版 ) 有 10 种药材用该法进行药材的有效性评价。其主要特点为：灵敏度高，可达 10 -4 g/ml ~10 -7 g/ml ；准确度高，相对误差为 2 ％ ~5 ％。中药中有紫外吸收的成分或本身有颜色的成分，在一定的浓度范围内，其溶液的吸收度与浓度符合朗伯 - 比尔定律，均可用此法进行分析。本法适于大类成分的含量测定，如总黄酮、总蒽醌、总生物碱等。

2. 定量测定法

　　测定时，应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照，采用 1cm 的石英吸收池，在选（规）定的吸收峰波长 ±2nm 以内测试几个点的吸光度，或由仪器在选定波长附近自动扫描测定，以吸光度最大的波长作为测定波长。一般供试品溶液的吸光度读数，以在 0.3 ～ 0.7 之间的误差较小。当溶液的 pH 值对测得结果有影响时，应将供试品溶液和对照品溶液的 pH 值调成一致。

　　用于含量测定的方法一般有以下几种。

(1) 对照品比较法凡溶液中待测物质吸收符合朗伯 - 比尔定律，则分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的 100 ％ ±10 ％，所用溶剂也应完全一致，在该物质的最大波长下测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度后，按式 3-3 计算供试品中被测溶液的浓度：

C x ＝ ( A x ／ A R ) C R 式 (3-2)

　　含量＝ ( C x × D ) / W ×100 式 (3-3)

　　式中 C x 为供试品溶液的浓度； A x 为供试品溶液的吸光度； C R 为对照品溶液的浓度； A R 为对照品溶液的吸光度； D 为稀释倍数； W 为供试品取样量。

（ 2 ）吸收系数法先测出对照品在 λ max 下的吸光度，然后求得吸收系数；也可从有关手册或药典中查得有关化合物的吸收系数。采用与对照品相同的溶剂，配制供试品溶液，在相同的波长处测定其吸光度，求出吸收系数，计算含量。

　　含量％＝ [( ) x /( ) R ]×100% 式 (3-4)

　　式中， ( ) x 为供试品的百分吸收系数； ( ) R 为对照品的百分吸收系数。

　　用本法测定时，应注意仪器的校正和检定。

（ 3 ）标准曲线法从待测物质的吸收光谱图上选定某一最大吸收波长，用一系列不同浓度的标准溶液在该波长处分别测得它们的吸光度，用吸光度对浓度作图。若待测物质对光的吸收符合朗伯 - 比尔定律，应得到一条通过原点的直线，即标准曲线。在同样条件下测定样品溶液的吸光度，在标准曲线上可读出样品溶液的浓度。