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Transwell是检测细胞侵袭能力的检测方法

发布时间：2011-10-22 15:16:54 来源：文档文库

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Transwell是检测细胞侵袭能力的检测方法
我们所使用的是Chemicon公司的ECM554，基质胶已经包被好了，买来就可以用，很方便，而且我们算过，跟自己买胶来包被价格相差不大。这种胶4度下很软，37度则变得比较坚硬，因此用前应先放在培养箱中10分钟作用，使胶完全凝固。
该试剂盒对穿过膜的细胞进行荧光染色，再用裂解液裂解细胞后检测荧光值。我们在实际使用的时候对穿过膜的细胞采用1％结晶紫染色，镜下计数细胞数目。结晶紫也可以用33%醋酸溶解，再用酶标仪570nm检测，同样可以反应穿过细胞数
因为基质胶的厚度直接影响穿过膜的细胞数，因此建议有条件的话还是买这类已经铺好胶的试剂盒，比较可靠。
说明书该公司网上可以下载，对原理也有比较详细的阐述，可以去查一下。
我们做的时候，上室用0.5%BSA的培养液，下室用5%血清的培养液，下室血清的浓度可根据细胞类型的不同进行调整，如果细胞侵袭能力强，可适当降低血清浓度，否则可适当提高血清浓度。
需要注意的是：
1。上室内的细胞数目要适当，过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果用计数法的话将难以计数；最少也要保证在收样的时候，上室内还要有细胞存在。具体细胞密度需要自己摸索。
2。细胞计数的准确性对结果影响很大，各组间最好不要分开计数。尽量用同一密度的细胞悬液给予不同处理，保证各组细胞量一致
3。对细胞的处理不可影响细胞生存。否则难以肯定是细胞量的改变还是侵袭能力改变

侵袭小室其实不止是transwell的，其它像Boyden chamber、Thincert也挺好用的。我用过Thincert，个人感觉不错，而且价格便宜，是grelner的，孔径8微米用于24孔板的一个才45块人民币，而且可以零买，不想transwell，总是一箱一箱的卖，实在是太贵了！
侵袭实验要结合实验目的，不一定非要包被的。
下面奉上用Thincert做侵袭实验的步骤（摘自《A quantitative cell migration assay using ThinCert™ cell culture inserts》，大家如需要，可用google搜之）：
1. Prepare cell cultures according to standard cell culture procedures
2. Starve cells overnight in serum-free medium with 0.2 % BSA
3. Harvest cells and wash them twice in PBS
4. Resuspend cells in serum-free medium with 0.2 % BSA to an appropriate final cell concentration (e.g. 106/ml)
5. Place 24 well ThinCertTM cell culture inserts in the wells of a CELLSTAR® 24 well cell culture plate
6. Add 600 µl culture medium with or without chemoattractant to each well of the cell culture plate
7. Add 200 µl cell suspension to each cell culture insert
8. Incubate the cell culture plate for 3-24 h in a cell culture incubator at 37°C and 5 % CO2
9. Remove the cell culture medium from each well of the cell culture plate and replace it by 450 µl serum-free culture medium with 8 µM Calcein-AM
10. Incubate for 45 min in a cell culture incubator at 37°C and 5 % CO2
11. Remove the culture medium from the cell culture inserts
12. Transfer the cell culture inserts into a freshly prepared 24 well cell culture plate containing 500 µl prewarmed Trypsin-EDTA per well
13. Incubate for 10 min in a cell culture incubator at 37°C and 5 % CO2, agitate the plate from time to time
14. Discard the cell culture inserts and transfer 200 µl of the Trypsin-EDTA solution (now containing the migratory cells) from each well into a black flat bottom 96 well plate
15. Read fluorescence in a fluorescence plate reader at an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 520 nm

从第9步开始计数侵袭细胞时，这份说明书用的是荧光标记，但这种方法成本高而且繁琐。我做的时候改为giemsa染色，发现效果不错，具体如下：
9.侵袭实验完成后，取出小室，用棉签小心将膜上表面的细胞擦拭去除；
10.用手术刀片小心沿小室边缘将膜切下；
11.把膜下表面向上放在一个洁净的24孔板的孔中；
12.甲醇：冰醋酸（3：1）固定10min后用10％giemsa染色；
13.在显微镜下随机选取5个视野计数细胞（即染成紫红色的点，未着色的多为细胞碎屑）计数并拍照留念

Transwell细胞体外侵袭实验

概述

　　目的:总结并改进细胞体外侵袭实验的操作经验。方法：采用改进后细胞体外侵袭实验分别研究不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810 胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱；粉防己碱对HUVEC 人类脐静脉内皮细胞迁移能力的抑制作用；VEGF 对人结肠癌HT229 细胞体外侵袭能力的影响。结果:改进后侵袭试验定位准确，结果清晰。结论：按照作者建议的方法操作，能够缩短实验时间,有助于提高细胞体外侵袭实验的质量。细胞体外侵袭实验主要应用于各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响及一些抑制血管生成的新药研究,但在具体实验中获得真实、最佳实验结果的图像,并借以说明问题并非简单。很多研究人员在此方面花费了很多时间和科研经费,从刺激实验用的细胞到苏木素染色,看似简单的实验步骤中有很多环节需要研究者注意.

材料与方法

　　1. 1

　　Matrigel：Becton Dickinson Compary, - 20 ℃保存；

　　Tanswell plate：Costar ,USA , # 3422 ,聚碳酯膜微孔直径为8μm；

　　苏木素染液，梯度乙醇，二甲苯溶液。

　　1. 2 趋化因子的制备　取传代第二天长势良好的NIH3T3细胞,无血清培养基轻柔漂洗两次; 加入无血清培养基,37℃,5 %CO2 培养24 h～48h，收集细胞培养上清；4 ℃,12 000rpm 离心,10 min ,取上清；0.22 μm 滤膜过滤除菌；分装,在- 20 ℃保存。

　　1. 3

　　transwell 培养板准备　所有操作均需无菌操作。-20℃保存的Matrigel 在冰上保2℃～8℃过夜融化。在冰上用预冷的枪头吸取100μl Matrigel 加入冰预冷的300μl 无血清培养基中,充分混均。取上述稀释的Matrigel 25 μl 加入transwell 板上室,覆盖整个聚碳酯膜,37 ℃,30 min ,使Matrigel 聚合成胶。已铺好Matrigel的transwell 培养板置于37℃可保存2 周。

　　1. 4

　　Matrigel 侵袭实验(Matrigel Invasion Assay)刺激后的各组细胞用PBS 漂洗3 次。以常规方法用无血清培养基制备单细胞悬液,5 ×105个细胞/ ml ,每组细胞各分为两部分。胎盘兰拒染实验,细胞活力需大于95 %。Transwell 培养板上室加入100μl 细胞悬液( 5 ×104 个) 并加入无血清培养基200 ul 。Transwell 培养板下室加入500μl 趋化因子,37℃,5 %CO2 培养24 h。用湿棉签轻轻擦去Matrigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞。小心取出上室,用线拴住,并做好标记,用冰预冷的甲醇固定30 min。苏木素染色1 min。梯度乙醇脱水(80 % ,95 % ,100 %) ,二甲苯透明。小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来,置载玻片上中性树脂封片。附着于聚碳酯膜下表面的细胞在高倍镜下( ×400) 随机取6 个视野[1 ] 计数,取平均数。重复实验两次。

注意事项

　　2. 1

　　NIH3T3 细胞制备的趋化因子与胎牛血清　趋化因子是能使细胞产生趋化运动的一类细胞因子[2 ] 。目前利用NIH3T3 细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验的实验室比较多,时间较长且实验步骤繁琐。众所周知,胎牛血清中有趋化因子,我们在不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810 胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验中发现用胎牛血清和用NIH3T3 细胞制备的趋化因子做细胞体外侵袭实验效果是一样的,两组迁移的细胞数很接近。在实验时间上，用NIH3 T3细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为1 周,而用胎牛血清作趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为2 d ,实验时间节省了很多。因此认为可以用胎牛血清来代替NIH3T3 细胞制备的趋化因子。

　　2. 2 细胞的准备　所需细胞应处在对数生长期,细胞活力需大于95 %。如果细胞活力小,就会造成细胞穿透能力下降,影响实验结果。

　　2. 3 擦去Matrigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞　先用干棉签将上室内液体吸去,再用蒸馏水浸湿的棉签轻轻擦去Mat rigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞,如果没有擦净聚碳酯膜上表面的细胞,在细胞计数时就会将没擦掉的细胞也计进来。尤其是细胞为圆形的时候,就会分辨不出是穿过去的细胞还是没穿过去的细胞,对于长梭形细胞来说,穿过去的细胞为长梭形,没穿过去的细胞多为圆形。

　　2. 4 苏木素染色　上室浸泡在新苏木素中的时间为1 min ,用过多次的苏木素为2 min。在研究粉防己碱对HUVEC 人类脐静脉内皮细胞迁移能力的抑制作用没有将多余苏木素洗去,直接脱水、透明,造成细胞图片背景模糊,细胞不清楚。在作不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810 胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验时我们将其置于盛有自来水的烧杯中,反复漂洗几次,将多余苏木素洗去再行脱水、透明;这样做出的细胞图片背景干净,细胞清楚。

　　2. 5 脱水和透明时间　脱水时间各为1 min ,在二甲苯中的时间不要过长,以2 min～3 min 为宜;尤其是同时操作多个样本时,时间过长就会造成部分聚碳酯膜从上室基底部自动脱落下来,上室间粘连在一起,造成样本混淆,实验失败。建议在最后一步实验时需二人协做,一人辨别并取出样本,一人小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来,置载玻片上中性树脂封片并及时编号。