河流水样中微生物的梯度稀释涂布及培养
1、 实验目的
1.1河流水样中微生物的梯度稀释涂布
1.1.1掌握使用无菌操作技术
1.1.2用稀释涂布平板法分离培养水样中的微生物
1.2微生物细胞的显微计数
1.2.1了解血细胞计数板的构造及原理
1.2.2掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法
2、 实验原理
2.1河流水样中微生物的梯度稀释培养
2.1.1平板菌落计数法
平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落代表原样品中一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌数。
3、 实验仪器、试剂与菌种
3.1河流水样中微生物的梯度稀释涂布
3.1.1实验仪器
10~100ul移液器及配套的移液枪头、1ml无菌EP管、250ml三角瓶、试管架即用于稀释的试管、培养皿、涂布器、酒精灯
3.1.2试剂和菌种
河流水样1瓶
3.2微生物细胞的显微计数
3.1.1实验仪器
血细胞计数板、显微镜、1ml无菌EP管、100~1000ul移液器及配套的移液枪头、吸水滤纸
3.1.2试剂和菌种
Jurket细胞
4、 实验步骤
4.1河流水样中微生物的梯度稀释涂布
4.1．1把事先已经准备好的固体培养基在微波炉中中火加热溶解3min，待其冷却至60~70摄氏度，来超净工作台上无菌操作将培养基等量、均匀倒入已灭菌并干燥的4个培养皿中，轻轻摇动培养皿，使其布满平皿底，每个平皿装量25ml，厚度达3~4mm。
4.1.2在实验台上用1ml移液器移取已摇匀的河流水样0.5ml放入无菌EP管中，随后带入超净工作台。
4.1.3在超净工作台里用1ml移液器移取EP管中河流水样0.5ml注入无菌试管中（内含4.5ml无菌水），充分混合均匀（10-1浓度）。
4.1.4用1ml移液器移取0.5ml10-1浓度的水样稀释液，注入无菌试管中（内含4.5ml无菌水），充分混合均匀，进行10-2梯度稀释；再用换了新的无菌吸头的移液器移取0.5ml10-2浓度的水样稀释液，注入无菌试管中（内含4.5ml无菌水），充分混合均匀，进行10-3梯度稀释；同样步骤重复，分别进行浓度梯度为10-4和10-5稀释。
4.1.5依次从各浓度（10-2、10-3、10-4、10-5）水样稀释液中吸取100ul,尽量均匀地打在培养基上，用无菌涂布器涂布平皿，使涂布均匀。每组一个平板，即10-2、10-3、10-4、10-5梯度各涂布一个平皿。
4.2微生物细胞的显微计数
4.2.1在加样前，对计数板的计数室进行镜检，观察并确定使用的是25x16规格计数板。
4.2.2在清洁干燥的血细胞计数板上盖上一片清洁干燥的盖玻片，用移液器吸取适量的Jurket细胞悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，使计数室内均能充满菌液且加样时计数室不可以有气泡产生。
4.2.3加样后静置5min，将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜并调节显微镜光线的强弱适当。开始计数，每个计数室选5个中格（选四角及中央一个中格）中的菌体进行计数。
5、实验结果与讨论
表1 用血细胞计数板对Jurket细胞悬液计数结果
讨论：本次计数过程中，对于菌团的计数存在一定误差，这对实验结果会造成一定影响；且实验只做了一个浓度的菌液计数，对于计算实际菌数也会造成一定影响。
6、 实验结论
本次实验是对河流水样中微生物的梯度稀释涂布及微生物细胞的显微计数的实践，通过本次实验，更加掌握了实验操作过程及注意事项。
本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/f09662c548d7c1c709a14593.html
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