固定化酶的相关知识

固定化酶的相关知识

固定化酶的定义：

固定化酶技术是将酶用人工方法固定在特定载体上, 进行催化生产,因而固定化酶一般可以被认为是不溶性酶。

固定化酶的特点：

优点:1.易于将固定化酶与底物产物分高,便于后续的分离和纯化;

可以在较长时间内连续生产;

酶的稳定性和最适温度提高;

酶反应条件容易控制;

可以增加产物的收率,提高产物质量;

酶的使用效率高,使用成本低;

7.适于产业化连续化自动化生产

缺点:1.在固定化过程中,酶活力会损失;

生产成本提高,工厂初期投资大;

只能用于水溶性底物,适合于小分子;

4.不适宜于多酶反应,还需要需要辅助因子的协助才可以有效反应

固定化酶的方法：酶的固定化方法主要有四类：吸附法、包埋法、共价键法、交联法。

吸附法：吸附法是最简单的固定化方法，包括物理吸附和离子交换吸附。物理吸附法常用的吸附剂有活性炭、硅藻土、多空玻璃、多孔陶器、硅胶、氧化铝、羟基磷灰石等；离子吸附法是酶与载体通过范德华力、离子键和氢键等作用力固定。

包埋法：包埋法即酶在载体(如聚丙烯酰胺凝胶、矽酸盐凝胶、藻酸盐、角叉菜聚糖等)中发生聚合、沉淀或凝胶化而被固定的方法。包埋法常用的载体主要有：明胶、聚酰胺、琼脂、 琼脂糖、聚丙烯酰胺、光交联树脂、海藻酸钠、火棉胶等。

共价键法：共价键法是利用化学方法将载体活化，再与酶分子上的某些基团反应，形成共价的化学键，从而使酶分子结合到载体上。该方法使用广泛，固定化酶与载体连接牢固，不易脱落，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。 共价键结合法常用的载体有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳素、氨基酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物等。

交联法：使酶与带两个以上的多官能团试剂进行交联反应，生成不溶于水的二维交联聚集体， 交联形成的固定化酶称为交联酶。与共价结合法一样，都是靠化学结合的方法使酶固定化，二者的区别在于交联法使用了交联剂。常用的交联剂有戊二醛、蹂酸。交联法—般作为其它固定化方法的辅助手段。

新型固定化方法：开发新型酶固定化方法的原则是：实现在较为温和的条件下进行酶的固定化，尽量减少或避免酶活力的损失。通过辐射、光、等离子体、电子等新方法均可制备高活性固定化酶。

固定化酶在制药工业上的应用

固定化酶或固定化细胞在医药工业上已经得到应用,尤其在半合成抗菌素工业和氨 基酸制备工业上已达到工业生产规模。

氨基酸光学异构体的拆分

本田边制药厂采用固定化氨基酞化酶选择性地水解N-乙酰基DL型氨基酸中N-乙 酰基L型氨基酸,生成L氨基酸和N-乙酰基D型氨基酸,然后使用结晶方法分离出L型氨基酸，N-乙酰基D型氨基酸可以进行外消旋化变成D L型混合物,再进行拆分。此法已于1969年投入工业生产。这种方法优点是收率高,工艺简单,并可自动化、连续化,制备成 本可下降10%。1974年日本利用这个方法进行L-蛋氨酸,L-苯丙氨酸,L-撷氨酸,L-色氨酸 和L-丙氨酸的生产。此法也可用于乙胺丁醇和 L-多巴的制造。

2.氨基酸和有机酸的合成

1973年日本田边药厂采用聚丙烯酞胺凝胶包埋大肠杆菌细胞（内含有天门冬酰胺酶）

,做成固定化细胞,用于L-天门冬氨酸的生产(以延胡索酸为原料),产率可达95%,成本下 降40%,固定化细胞可使用4个月。另外,固定化酶(或细胞)技术尚可用于制备色氨酸、酪氮酸、瓜氨酸、赖氨酸、谷氨酸、乌氨酸、苹果酸等，其中赖氨酸、瓜氨酸、乌氨酸、

苹果酸已投入工业生产。最近在国际第六届生物物理会议上曾报道，用角义菜胶包埋菌 体,用于工业上制备L-天门冬酰胺酸和苹果酸。

3.在半合成抗菌素工业中的应用

(1) 6-氨基青霉烷酸的制备：6-氨基青霉烷酸（6-APA）是半合成抗菌素中间体。采用固 定化酶技术,可将青霉素G直接水解生成6-A P A。固定化酶法制备6-A P A的工艺简单,

生产中无三废。近年来国外对此研究较多,1973年已应用于工业化生产。固定化酶技术还 可用于制备氨苄青霉素和羧苄青霉素。

（2 )头孢菌素的制备：7-氨基脱乙酰氨基头孢烷酸( 7-ADCA)是头孢菌素的母核,当母核 中引入不同侧链,可制得各种新头抱菌素。以青霉素G为原料,通过一系列化学反应,可得 到苯乙酞化7-ADCA,如采用化学法,很难由苯乙酸化7-ADCA得到7-ADCA。但采用固定 化酶技术则很容易去除侧链生成7-ADCA。目前该法已在进行7-ADCA中试规模生产。

以7-ADCA为原料,在固定化酶存在下还可制成先锋霉素4号.

4.甾体类药物的制备

许多甾体化合物,如果仅用化学方法很难制得,但使用微生物的酶可以很容易进行甾体化合物的转化。例如用化学合成法,由Reichstein化合物S制备强的松龙,需要7步合成 反应,而且得率低,有副反应产生。如果采用固定化11-羟化酶,使Reichstein化合物S一步转化为皮质醇，然后再通过Δ1，2脱氢酶转化为强的松龙。Larrsoon等曾研究用l-2 kg聚丙烯酰胺凝胶包埋单纯棒状杆菌细胞,用于甾体Δ1，2脱氢反应制备强的松,每年可生产250 k g。

5.利用固定化酶制备单一对映体药物2-芳基丙酸

(2-APA) 类非甾体抗炎药的( S) -构型的生理活性或药理作用远大于(Ｒ) -构型，采用固定化酶Novzym435进行布洛芬消旋体的外消旋转换，所得到的光活性的( S) -布洛芬，其对映体量比可达97. 5%。Goto等为了增大固定化酶的活性, 减少酶用量, 用表面活性剂处理固定化酶, 使酶活性大幅度提高, 最多的达100倍。目前, 2 -芳基丙酸类的药物, 如( S) -布洛芬、( R ) - 酮洛芬等在国外已上市, 而奈普生一开始就是以单一对映体药物进入临床的。

除上述外,固定化酶尚可用于维生素中间体α-酮基古龙酸的合成。干扰素诱导体PolyI:C辅酶 A和鹅去氧胆酸的制备。在鹅去氧胆酸合成中。用化学法制备,需要经过8个步骤,收率仅l0 %如果采用化学法和固定化酶法相结合的方法,仅要4个步骤,而且可以提高收率,降低成本4倍,充分显示固定化酶的优越性。

酶催化

1.1 酶催化概念

酶催化是介于均相与非均相催化反应之间的一种催化反应方式,它既可以看成是反应物与酶形成的一种化合物,也可以看成是酶表面产生的吸附物质,然后再进行反应的。酶在加速或者减慢化学反应方面发挥着重要的意义,在一个活细胞中同时进行着几百种不同的反应,这都是借助于细胞内部相当数量的酶来完成的,它们的反应与其他催化反应一直,催化率与温度、酸碱值以及敏感性方面都有着一定的关系。

1.2 酶催化特点

酶催化技术在应用的过程中存在着自己独特的方面,酶催化剂在通常情况下都具备着反应条件温和,具备着很高的区域选择性和立体选择性,并且反应大多数都可以在水中直接进行着。随着制药工业对手工业化合物需求量的不断增加、人类环保意识的不断增强,酶催化技术越来越受到人们的重视,已成为化学制药领域研究最多的技术之一。同时,近年来,随着生物技术和基因工程的应用,酶催化技术的性能也得到了很大的提升,酶催化反应以及生成成本也得到了显著的提升。在这种社会背景下,人们对酶催化剂的认识越来越深入,极大的改变了传统酶催化反应要求提出了许多的新内容。

1.3 酶催化技术发展

传统的酶催化反应主要在水相中进行,但自1987年Kilibanov等用脂肪酶粉或固定化酶在几乎无水的有机溶剂中成功地催化合成了肽以及手性的醇、脂和酞胺以来,对酶在非水相介质的催化反应技术的开发及研究报道迅速增加,特别在手性药物的不对称合成及手性药物拆分的生物技术开发中得到了很多应用。由于脂肪酶本身是一种界面酶,在非水介质中比较稳定,因此，具有良好的工业化应用前景。

非水相酶催化反应是酶催化反应中的一个重要方面。非水相溶剂通常具有可增加底物溶解度,改变反应的平衡方向, 提高反应的立体选择性,抑制水参与的副反应,易于消除底物和产物的抑制作用，加快生物催化的速率和效率等优点，在药物及药物中间体和食品等方面具有较大的应用价值。目前非水相中的酶催化技术已衍生出以下几类体系:

无溶剂系统

无溶剂系统是指以纯底物作为溶剂,没有其他溶剂的稀释和参与。通常在类似体系中,底物浓度高, 反应速度快,转化效率高, 并避免了溶剂使用和回收等问题。无溶剂系统与其他反应系统相比具有明显的优势,但局限于底物为液态的酶催化反应,在实际应用时受到了较大的限制。

有机溶剂系统

有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。它包括：非极性有机溶剂--酶悬浮体系(微水介质体系)，与水互溶的有机溶剂--水单相体系，非极性有机溶剂--水两相/多相体系。

反胶束体系

反胶束是表面活性剂溶解于非极性溶液中形成一个围绕极性核的纳米聚集体,为一种低水含量的油包水微乳液。极性核中的水不同于普通水,其黏度较高,酸性和极性比普通水低,其中的水可以溶解原本不溶的物质,如脂肪酶等生物催化剂。

低共熔混合物

所谓低共熔混合物是指将两种纯净物按不同比例相混合,在一定组成下,相图上出现了一个最低熔化温度点,即低共熔点。此时形成的混合物叫低共熔混合物。低共熔点一般比任何一种纯净物的熔点都低。当体系温度高于低共熔温度时,体系中就会产生包含各种反应物的液相。实验证明,以该体系为反应介质进行酶促反应时,反应正是在低共熔混合物中的液相发生的。

低共熔多相混合物体系中的酶促反应不需溶剂,成本低、污染少、纯化过程容易,避免了有机溶剂对酶活性的影响,有广阔的应用前景,对食品,制药等产品纯度要求较高的行业来说更具有深远的意义。但目前对它的研究主要限于肽类和酯类的合成。

超临界流体

超临界流体是一种超过临界温度和临界压力的特殊物质,物理性质介于液体和气体之间作为酶反应的介质。超临界流体具有黏度小、易扩散、溶解性好、无毒及产物易分离等特点。常用作超临界流体的有: CO2、SO2、C2H4、C2H6、C3H8、C4H10 、C5H12、CCIF6及SF6等,其中最常用的是CO2。

离子液体

离子液体由有机阳离子和无机或有机阴离子构成, 在室温或室温附近温度下呈液态,不易挥发,不造成环境污染, 被誉为绿色溶剂。理论上改变不同的阳离子/阴离子组合可以合成多种不同的离子液体。离子液体易于与催化剂一起循环使用,为生物催化反应提供了新的介质, 可提高催化剂的活性和选择性。对于易使酶失活的离子液体,通过改造其结构、加入缓冲液或调节pH 值等手段恢复酶活力,使其成为融酶离子液体。虽然有关离子液体的研究目前较为活跃,但离实际应用还有一段距离。

此外，通过对酶和溶剂系统全方位的改造和有机组合, 非水相酶反应将在有机合成化学、不对称合成、过程化学等方面得到更多的应用,将为药物、食品、新材料等的制备和生产开辟新的途径。

1.4酶催化在制药领域的应用

在传统的制药工艺中,酶催化技术的应用主要是以酶降解反应为主进行的,是利用酶降解技术在化学类药品中进行催化,从而使得原材料中的蛋白质发生降解,并产生出许多的活性片段,这些活性片段在经过降解、处理之后便会发生活性肽反应,从而使得这些氨基酸进行分解、促进。伴随着科学技术的发展,酶催化工艺的应用越来越广泛,已经成为分离、检测和生产技术中最为常见的一种,它的应用为化学制药工艺的应用提供了一个全新途径。

目前,酶催化技术在医药方面的应用是当前最为关注的领域之一,这主要是因为医药产品一般附加值高,且大多是光学活性物质,作为十分优良的手性催化剂----酶,用于多种高效手性药物的合成及制备将十分有效,潜力巨大。

（1）.酶催化的立体选择性在制药工业中的应用

酶催化的立体选择性反应是当今手性药物合成研究的热点之一，与经典的有机合成相比，酶催化的反应条件温和，立体选择性好，可避免因反应条件苛刻而导致的消旋化、异构化及重排等副反应。三废污染较少，被称为绿色化学。此外，作为反应催化剂的酶可循环使用。以下通过酶催化的化学反应类型综述其在手性药物合成中的应用，重点强调其立体选择性。

1 水解反应

水解反应在酶催化手性合成中应用最为广泛，酯、环氧化物等可通过酶的立体选择性水解、分离得到光学纯的单一异构体。此类反应一般在水中进行，有时也加入有机溶剂以增加底物的溶解度，溶媒的水分子参与反应。例如，依卡曲尔的合成，消旋卡多曲是Bioproject公司研发的腹泻治疗药，1993 年上市。随后的研究发现其(R)-型异构体右卡多曲具有调节胃肠道功能紊乱的药理活性，而(S)-型异构体依卡曲尔则具有抗高血压活性。原料2- 苄基-1,3-丙二醇的2 位碳是一个潜手性中心，二酯化后，利用荧光假单胞菌中的脂肪酶可以立体选择性水解一个酯基，进一步衍生得到(S)-构型。

2 酰化反应

酶催化的不对称酰化反应基本可分为两型：(1) 酰化含有潜手性中心的化合物生成手性酯；(2)立体选择性酰化消旋体中的一个异构体。

在结构复杂的手性药物及中间体的合成中,酶法合成常常会表现的比其他的合成方法更具有优势,在Glaxo Welcome公司正开发的一种抗白血病的药物核糖嘌呤类化合物(506U78),使用脂肪酶CAL-B为酰基化试剂,可选择性合成5c-核糖乙酯,区域选择性高达99%，如此高的选择性是用一般常规的化学方法所不能达到的。

3 还原反应

酶催化的还原反应可立体选择性还原羰基化合物，生成特定构型的手性醇。常用还原剂为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，因价格昂贵不易用于放大生产，因此工业上的酶催化还原一般是以微生物的整细胞直接用于反应体系，NADPH可通过微生物的葡萄糖代谢而循环再生使用。如，左羟丙哌嗪的合成。利用1-苯甲酰氧基-3-氯-丙酮(46)在Baker酵母菌的催化下2位羰基被立体选择性还原成羟基，再用1- 苯基哌嗪对Cl 原子进行亲核取代，同时脱去苯甲酰基得到( S ) - ( －) - 异构体左羟左羟丙哌嗪，ee值 可达95％。

4 氧化反应

酶催化的氧化反应可以选择性氧化双键或某些非活泼的碳氢键，生成特定构型的羟基化合物或环氧化物。如，可的松的合成。可的松是肾上腺皮质激素类药物，也是很多甾体药物的重要原料。其C11α- 位羟基化是关键步骤，一般使用黑根霉中的11α-羟化酶催化中间体16α,17α- 环氧黄体酮转化生成11α-羟基化物，进而制备可的松。

综上所述，酶催化的立体选择性反应在新药研究中已得到了广泛的应用，而且已有成功用于工业化生产的实例。相信随着生物技术的进一步发展，将会有更多的酶被用于手性药物的合成。

（2）.酶催化技术在制药工业中的应用

应用酶催化技术可以生产许多成品药及医药中间体。它是通过以制造初级代谢产物、中间代谢产物、次级代谢产物及催化转化和拆分等形式来进行的。以下重点介绍几个制药领域中酶催化技术的应用:

(l)氨基酸。化学合成的氨基酸均为D,L混旋型产物,药效差。50年代以来猪肾和米曲氨基酞化酶已被用来拆分乙酞一D,L一氨基酸。1969年日本田边制药会社成功地利用固定化酶催化技术连续拆分D,L一氨基酸,生产L一氨基酸和乙酞一D一氨基酸,乙酞一D一氨基酸用化学消旋后再在固定化酶柱上拆分大量生产L一苯丙氨酸、撷氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和丙氨酸。南京化工大学国家生化工程研究中心成功地利用多酶系统从D一对经苯海因转化合成D一对经苯甘氨酸,目前正在开发与膜分离相结合的新工艺,他们还开发了酶法与原位结晶分离藕合技术生产L一丙氨酸的新工艺,并已成功进行了工业化生产。

(2)有机酸。酶催化已用于柠檬酸、L一苹果酸、L一酒石酸、L一乳酸等多种具有光学活性有机酸的生产。有研究将酶催化与原位结晶分离技术祸合生产L一苹果酸,底物的转化率接近100%,大大降低了生产成本。

(3)杭生素。多种青霉素酞化酶(如6一氨基青霉烷酸、氨节青霉素和轻氨青霉素)、头抱菌素酞化酶(如7一烷基头抱烷酸)、链霉素等都是酶催化技术应用大规模抗生素工业生产的实例。

(4)肽类药物。酶催化肤键合成可用来生产许多种多肽药物,如胰岛素、环抱菌素A等。酶催化合成甜味二肽是最为成功的例子。

除上面介绍的几个制药领域以外,酶催化技术还广泛应用于多种维生素(VB2、VB12)、甾体药物(氢化可的松、脱氢泼尼松、睾丸激素等)及核苷酸类药物(5’一核昔酸,3’一核昔酸)等的生产。可以说凡是以往可用化学方法生产的药或药物中间体,理论上均可用酶法代替,不仅如此,酶催化技术还可以制造用化学法难以完成的药物。然而即使理论和实践上均可能用酶法替代化学法,也不可能和不能排斥化学法,关键看哪个方法更高效、经济。将酶催化与化学合成巧妙地藕合已成为当今生物有机合成研究中一个重要的方向,它必将对光学活性药物的合成和应用产生积极的推动作用。

（3.）酶催化在药物分析中的应用

荧光光谱分析法应用于药物分析，已在药物有效成分分析鉴定、药物代谢动力学研究、临床药理与药效分析等方面取得一定发展，并广泛应用于生化分析、生物医学、临床分析等领域的痕量分析。

有些药物可利用其对某一特定体系的荧光猝灭作用而进行定量测定。如，HRP是一种对氢受体有特异性，对氢供体缺乏特异性的酶。利用HRP的催化体系测定H2O2，是一种既灵敏又专一的方法。对H2O2的测定是很多能产生H2O2的物质的测定基础。一些本身没有荧光的物质，在HRP／H2O2体系催化氧化下，产生二聚体而形成具有强荧光的物质。有研究利用苦参碱和氧化苦参碱对荧光试剂乙酸乙烯酯的定量猝灭作用，建立了测定苦参碱和氧化苦参碱的荧光分析方法。此外，荧光猝灭法还用于分析万古霉素、多巴胺等药物的含量。

1.5酶催化技术的应用前景

我国的化学制药技术及药物的生产与研制已经成为我国建设中的一个重要目标,而酶催化技术在化学制药中也占据了一个很重要的地位,我国的生命科学及化学领域的研究人员正在努力的对化学制药技术进行改进和提高,争取为我国的化学制药技术做出更大的贡献。酶催化制药技术作为制药技术中的重中之重,正受到全球各地更高的关注,它的发展也关系到中国制药技术,乃至中国经济的发展状况。

综上所述,酶催化已经成为有机合成和制药工业的重要手段。随着酶催化工程方面的发展以及可用酶的增加,将会有更多的工艺用于精细化学品和制药工业。酶催化仅仅是一个年轻的科学,发展空间巨大,其未来的发展前景也是无可限量的。

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/c25f8f75f11dc281e53a580216fc700abb6852fb.html