凡纳滨对虾微卫星DNA的筛选及其特性的研究解析

第16卷第1期

2007年1月上海水

产大学学报JOURNALOFSHANGHAIFISHERIESUNIVERSITYVol.16,No.1Jan.,2007文章编号:1004-7271(2007)01-0011-05

凡纳滨对虾微卫星DNA的筛选及其特性的研究

贾智英,全迎春,,1,21,21(1.,150070;

,)

32摘　,用放射性同位素[γ2P]ATP标记的(CA)15、

(AT)12、(AG)12、(AAT)8、(AAG)8做探针筛选阳性克隆。共获得微卫星序列152个,其中二核苷酸为核心的

微卫星序列:(AG)n>(AC)n>(AT)n,三核苷酸为核心的微卫星序列:(AAT)n>(CAT)n>(AAG)n。应用引物设计软件primer3.0设计引物105对。选择合成10对理论上易出现影子带的引物,筛选后用31个凡纳滨对虾个体对这些引物进行了评估,结果10对引物中有8对引物能扩增出谱带,其中1对扩增产物出现影子带,1对扩增产物为单态,有6对扩增产物出现多态。

关键词:凡纳滨对虾;微卫星DNA;重复序列;克隆

中图分类号:S917　　　文献标识码:A

Theisolationandcharacterizationofmicrosatellitemarkers

fromLitopenaeusvannamei

JIAZhi2ying,QUANYing2chun1,21,2,LIANGLi2qun,SUNXiao2wen11

(1.HeilongjiangRiverFisheryResearchInstituteChineseAcademyofFisherySciences,Harbin　150070,China;

2.CollegeofAqua2lifeSciencesandTechnology,ShanghaiFisheriesUniversity,Shanghai　200090,China)

Abstract:ThepartialgenomelibraryofLitopenaeusvannameiwasconstructedbymethodofsmallfragmentsDNAcloningandthepositivecloneswerescreenedwiththeprobes(CA)15,(AT)12,(AG)12,(AAT)8and

32(AAG)8labeledwith[γ2P]ATP.152sequencescontainingmicrosatelliteswereobtained.Thedinucleotide

repeatswere(AG)n>(AC)n>(AT)nandthetrinucleotiderepeatswere(AAT)n>(CAT)n>(AAG)nrespectively.105setsofprimersweredesignedwiththesoftwareprimer3.0.10primersthatthestutterbandseasilyoccurintheoryweresynthesizedand31samplesweretestedwiththem.Eightlocicangivebandsandsixhadadegreeofpolymorphisms,onewasmonomorphicandonehadstutterbands.

Keywords:Litopenaeusvannamei;microsatelliteDNA;repeatsequences;clone

[1]　　凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei),俗称南美白对虾,原分布于南美太平洋沿岸的水域,1988年

引入我国,因其生长迅速、抗病力强、肉味鲜美和出肉率高而成为目前国内外广泛养殖的优良品种之一,

[2]在我国虾蟹养殖业中占有重要的地位,养殖范围较广。微卫星分子标记(microsatellitemarker)是由

1～6bp串联重复序列构成,它具有分布广、含量大、多态性丰富及保守性等特点,

至今已被广泛地应用

收稿日期:2006203216

基金项目:国家自然科学基金(30271010)

作者简介:贾智英(1976-),女,山东蓬莱人,博士研究生,主要从事水产动物遗传育种研究。E2mail:xiaojiade41@163.com通讯作者:孙效文,E2mail:sunxw2002@163.com,Tel:0451-********

12上　海　水　产　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　16

卷

[3-5]于遗传图谱的构建、基因定位及遗传多样性分析等方面。目前,斑节对虾(Penaeusmonodon)和中

[6-8]国对虾(Penaeusorientalis)已筛选出较多的微卫星序列,但对虾间基因组的差异性大、通用性较差,

据报道

开[1,10][9]对虾属间差异为25%,亚属间基因组差异为9.4%。凡纳滨对虾微卫星筛选工作虽然已经展,但对其各类微卫星及微卫星分布特征方面还知之甚少。本研究在开发一批微卫星序列的同时,对其在基因组中分布特征进行分析,以期深化对凡纳滨对虾基因组的认识,为开发微卫星标记、开展深入的遗传标记辅助育种工作奠定基础。

1　材料与方法

1.1　材料

;(4DNA连接酶购于MBI公司;硝酸纤维素

(AT12、(AG)12、(AAT)8、(AAG)8和引物由上海生物工程公司(15合成。

1.2　方法

1.2.1　总基因组DNA的提取

按照梁利群等[11]提取基因组DNA的方法,提取基因组DNA。

[12]1.2.2　文库的构建与阳性克隆的筛选文库的构建与阳性克隆的筛选主要参考魏东旺

备按照分子克隆[13]的方法,并略加修改。限制性内切酶Sau3AⅠ对基因组DNA进行部分消化后,用蔗糖密度梯度离心筛选片断大小为250～1000bpDNA。杂交膜的制的方法进行。

1.2.3　序列测定及统计分析

将阳性克隆穿刺培养在LB培养基中,由上海生物工程公司进行测序。应用微卫星查找软件TandemRepeatsFinder(Version2.02)进行重复序列的查找,然后应用NCBI上的VecScreen(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html)软件去除载体序列,并将得到的微卫星序列按核心序列重复次数进行统计。

1.2.4　引物设计

用在线软件Primer3.0(http://www2genome.wi.mit.edu/genome

引物设计。

1.2.5　引物合成及其评估software/other/primer3.html.进行

)的10对引物(见表在所设计的引物中,选择合成理论上易出现影子带(重复碱基数为100bp±

1),并用31个凡纳滨对虾个体、2%琼脂糖凝胶电泳对所筛选的引物进行检测评估,所用统计指标为等位基因频率(allelefrequency,P)、观测杂合度(observedheterozygosity,Ho)、期望杂合度(expectedheterozygosity,He)和多态信息含量(averagepolymorphisminformationcontent,PIC)。公式为:

期望杂合度:He=1-Σpii=1n2

nn-1n222多态信息含量:PIC=1-Σpi-ΣΣ2pipji=1i=1j=i+1

其中n为等位基因数目;pi和pj分别为第i和第j个等位基因的频率。

2　结果

2.1　重组子及其杂交

本实验共得到5000个转化子,EcoRⅠ和HindⅢ双酶切检测重组载体所占的比率为90%,所以重

1期　　　　　　　　　　　贾智英,等:凡纳滨对虾微卫星DNA

的筛选及其特性的研究13

组子数为4500。

表1　10对微卫星引物筛选结果及其特性

Tab.1　Thescreenresultsandcharacterizationoftheprimers

位点

HLJN-001HLJN-002HLJN-003HLJN-004HLJN-005HLJN-006HLJN-007HLJN-008HLJN-009HLJN-010

引物序列

GCACCTGAAGGACATGTGTG

ACAACCAGCCTGTCCTGTTTGCATCAGTAGAACAAAAGCATCAGGCCAAAAGACAATTTTGGATCCTTATAAAATGCGGCCAAATGTGCACATCTCGTTTGGATGGGAGGCTAAAAGATGGTGAGGGTGAGGCGAGCATTTTGATGCGACGGAAAATCGAGTTGTTTCCAACAAAGGAACCTCCGTACGTAAGTCCTGCAAAAGAAACTGCCGTTCAACTATATATCAGCAGCACAGTGGCAAATTTCTTGAGGCACAGAGGCTTCTCCTTGCGGAGGAAGGAGGATAAAGTTGGTTTCTGAATTTGCGTATG

重复序列

(AG)9GG(AG)7GG(AG)47C(GA)2A(AG)5(AAAGAA)2(AG)27(GA)42…(TA)4(CA)8T(CA)41

AG)43()7()(4()(AC)()7A()3(CA(CA)25CT(CA)20

重复类型非完美型混合型完美型非完美型

退火温度片段大小(℃)(bp)

60.1659.62421860.59.1360.6260.6460.0460.1059.8361.3959.9657.7757.0359.3260.5360.1760.00

296250235225203222249299373236

(GT)3(TG)20(AGTG)2(TG)22TTC(GT)6G

非完美型

(GT)13(TG)4

(TA)12(GA)(TAGA)4A(AT)(AG)49A(AG)10

混合型

(AT)(AG)A(AG)10TG(GA)(AG)3A(AT)(AG)6(CT)7C(CT)(TC)5TT(TC)6(AC)6(AT)(AC)12(AT)3GT(AT)4(TA)A(AT)4(GA)4(N)57(GA)37(GAGACA)6

混合型混合型

　　用[γ2P]ATP标记的探针杂交,得到阳性克隆168个,占3.73%,其中每张膜上的信号为3～17个,平均8.6个。

32

2.2　阳性克隆测序及重复序列分布特征

在168个阳性杂交信号中,共测出161个序列,其中51个序列测序结果不理想,将其反向测序后,只有10个序列两次测序结果得到了拼接。在所测得的序列中,含有微卫星的序列一共152个,重复碱基数大于或等于40的微卫星序列占总数的80.8%。统计所有的微卫星序列,其中含有(AG)n、(AC)n、(AT)n、(AAT)n、(CAT)n、(AAG)n的序列所占的

比率分别为45.9%、25.2%、16.0%、8.2%、3.7%、

图1　凡纳滨对虾微卫星大小分布

1.0%。以二核苷酸为重复单位的序列中,(AG)n>

Fig.1　Microsatellitesizedistributionof

(AC)n>(AT)n;在以三核苷酸为重复单位的序列

Litopenaeusvannamei

中,(AAT)n最多,其次为(CAT)n、(AAG)n,目的重

复序列(AAT)n的数目多于(AAG)n,但非目的重复序列(CAT)n的数目比目的序列(AAG)n多,大约是后者的3.5倍。从重复序列的次数上看,凡纳滨对虾的重复次数跨度很大,从4～119不等(图1)。

2.3　引物设计

在152个所筛选的含有微卫星的序列中,共设计引物105对,可到农业部北方鱼类生物工程育种重点开放实验室网站(www.fishbreeding.org)查询。

2.4　引物筛选及评估

10对引物中有8对引物能扩增出谱带,其中1对扩增产物出现影子带,1对扩增产物为单态,6对

14上　海　水　产　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　16卷

扩增产物出现多态(表2;图2)。除位点HLJN05、HLJN06外,其余6个位点的期望杂合度较高,均在0.

5以上,平均为0.7232。位点HLJN01、HLJN04、HLJN07、HLJN08、HLJN10多态信息含量高,而HLJN02

[14]

多态含量低,按Bostein等提出的衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标,前5个位点属于高度多态基因座,后1个为低度多态性。总体上各位点的等位基因数较多,等位基因数差异较大,平均每个位点12.1429,基因型丰富。除位点HLJN04外,经卡方检验其余位点观测杂合度与期望杂合度差异均极显著(P<0.01)。这可能是由于多年来凡纳滨对虾人工选择、非随机交配等原因造成的。

表2　10对微卫星基因座的遗传信息

Tab.2　Thegeneticinformationoftenpaiofprim位点

HLJN

HLJNHLJNHLJNHLJNHLJNHLJNHLJN

-------001002004010

退火温度(℃)

60606060

片断大小(bp)

237～426360

250212～355324～445237469

等位基因数

7bands

118918

0.2400.5200

-0.000

00.79410.04760.2609

0.52760.6642-0.00000.92910.66330.7315

0.79480.24320.6087-0.00000.92460.60760.7208

图2　凡纳滨对虾HLJN07基因位点的电泳图

Fig.2　AnalysisofPCRproductsfortheHLJN07locusinLitopenaeusvannamei

3　讨论

微卫星序列的筛选主要有两种方法,一是小片段克隆法,二是富集的方法。富集的方法目前应用较

多,该方法相对简单、快速,工作量小,获取的微卫星数目较多,但富集方法要经过两次PCR扩增,保真

[15]

性较低,引物筛出率较差,不适合微卫星序列较长的生物微卫星DNA的筛选,而小片段克隆法不存

[16]

在这些不足。对虾的微卫星序列一般较长,因此本次实验中微卫星DNA的筛选采用了小片段克隆法。

不同核心重复单元在基因组中的丰度是不同的,微卫星分子标记的筛选就是以丰度为基础的,因而在筛选微卫星分子标记之前,清楚丰度十分重要。研究表明,动物中微卫星DNA一般以CA/GT重复为主,植物中多以AT/TA或GA/CT重复为主。目前,已通过部分基因组测序的方法分别获得了斑节对

[7,17]

虾、中国对虾多种重复单元的含量。中国对虾两碱基重复类型中,AT重复数目最多,其次是AC和AG;三碱基重复类型中以AAT重复拷贝类别最多,其次是AAG和ATC。斑节对虾两碱基重复类型中,CT重复数目最多,其次是GT、AT、CG。本实验所筛选凡纳滨对虾两碱基重复类型中,AG最多,其次为AC和AT;三碱基重复中,以AAT最多,其次为CAT和AAG。这一结果与中国对虾和斑节对虾均不相

[9]

同,这也印证了“对虾基因组间差异较大”的结论

。

[18]

据Hamada等报道,人的基因组DNA中大于或等于40bp的微卫星序列占微卫星序列总数的12%,鼠中占43%,本实验得出在凡纳滨对虾中占80.8%,是人类中的6.7倍,小鼠的1.9倍。在对日

1期　　　　　　　　　　　贾智英,等:凡纳滨对虾微卫星DNA

的筛选及其特性的研究15本对虾的研究中表明对虾基因组中以二核苷酸为中心的重复单元的重复次数较多,但扩增产物电泳时

[17][19]影子带现象严重,很难能筛选出较好的微卫星分子标记。在人类中证明用三或四碱基为重复单

元的微卫星分子标记多态性高、等位基因差异明显和影子带现象少,因而一些学者倾向于用三或四碱基核苷酸做探针进行筛选。但对虾中以三或四碱基核苷酸为重复单元的丰度还未见报道,为此,一些学者

[7,11]在筛选对虾微卫星序列时不惜花费大量的费用对构建的文库进行直接测序。本实验借助其它对虾

所筛选的结果设计了探针,并得出了凡纳滨对虾中几种三碱基重复单元的丰度,从而深化了对凡纳滨对虾基因组微卫星序列的认识,并为开发其微卫星标记提供了技术支撑。

),PCR扩增时易发生Taq现在一致的观点认为重复序列较长(100bp±

影子带,从而干扰谱带的计数,引发计数错误。,的微卫星标记来说,影子带的现象并不严重(如图2)的重复序列被其它的几个碱基隔开各种遗传分析时,,。此外,本实验所设(HLJN06除外)。所以对虾中微卫星序列虽然较长,但如,仍是较好的分子标记。

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本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/c19e7ca8710abb68a98271fe910ef12d2af9a9a0.html