正确理解乙肝实验室检测结果
乙型肝炎病毒(HBV)感染的实验室检测是目前国内最为常用的检验项目，也是医患纠纷产生较多的领域之一。正确理解和解释乙肝实验室检验项目的临床意义，对于这些检验项目的实际应用有重要价值。下面就几个方面重点谈一谈。 一、乙肝“两对半”检查的意义 国内人群中，二十世纪八十年代中期以前出生的，乙肝病毒的感染率超过了10%，因而时至今日，乙肝“两对半”仍是目前国内医院最常用的乙肝病毒感染检测的血清标志物，也是医生和患者经常挂在嘴上的检验项目。在很多时候，甚至是体检，都会用到这些检验项目。乙肝“两对半”顾名思义，就是有五项判断乙肝感染的乙肝病毒抗原及其抗体的检验指标，即乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝表面抗体（抗HBs）、乙肝e抗原（HBeAg）、乙肝e抗体（抗HBe）和乙肝核心抗体（抗HBc）等。尽管这五项指标使用得非常多，但对其真正的含义，由于认识过程的原因，仍有不少误解。 1．HBsAg HBsAg于1963年由Blumberg在澳大利亚土著人血中发现，称为澳大利亚抗原(即以前所谓的“澳抗”)，后又称为肝炎相关抗原(HAA)，1974年正式定名为乙型肝炎表面抗原(简称为HBsAg)，存在于HBV的外壳部分。HBsAg有一个特异的共同抗原决定簇“a”和至少两个亚型决定簇“d／y”和“w／r”，最常见的血清型为adw、adr和ayw。我国绝大多数地区以adr为主，adw次之(于长江以南诸省与adr混存)；新疆、西藏、内蒙古自治区的本地民族几乎全为ayw。血清中检出HBsAg是乙型肝炎的早期诊断指标之一，出现于患者血清转氨酶(ALT)升高前2—8周，至恢复期HBsAg滴度逐步降低乃至消失，抗HBs出现。但有部分患者HBsAg在血清中可持续存在，原因可能是编码HBsAg的HBV的s区段和肝细胞DNA整合。在这种情况下，即使HBV已从人体内消除，肝细胞仍能不断地复制HBsAg。 HBV感染后，大部分人没有临床表现，但在血中可检出HBsAg，这类人通常称为HBsAg携带者。在我国这类人超过1亿，其中大部分将持续携带HBsAg数年、数十年乃至终身而无临床症状；小部分人在平衡被打破后，可发展为急性或慢性乙型肝炎，甚至肝硬化、肝癌。 HBV感染后绝大多数感染者外周血中可出现HBsAg， 含量在5ng～600μg/ml之间。据文献报道，到目前为止在献血员中所发现的HBsAg 携带者最低含量为0.2 ng/ml。含量高者可达2000μg/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg测定为阴性，如暴发性乙型肝炎、HBV的S基因发生变异等。急性重症乙型肝炎，肝细胞中以合成HBcAg为主，很少或不合成HBsAg，从而使外周血中无HBsAg。HBV的前S/S基因编码HBsAg，构成病毒外膜，根据所带亚型决定簇的不同分为adw、adr、ayw和ayr。a决定簇具有很高的免疫原性，在HBV的自然感染或注射HBsAg 疫苗可引起抗HBs应答。如S基因145密码子变异使得其原来的甘氨酸被精氨酸替代时，可致a决定簇的抗原性发生改变，使机体产生的抗体对变异株无作用，且可引起HBV感染患者血清中同时出现HBsAg和抗HBs。同时乙肝疫苗接种也不能有效预防此类变异病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的变异有自然变异和逃避免疫变异，变异可发生在多个部位，而且几处突变可同时存在，这些变异有助于病毒携带状态的持续存在。近来，有研究表明，前S1区丢失突变（氨基酸58～118）是引起HBsAg阴性的HBV感染的重要原因，S启动子位于前S1，是合成HBsAg的调节元件，前S1的丢失突变则会影响S启动子的功能，进而影响HBsAg的合成。 HBsAg不仅存在于血液中，而且还存在于许多体液和分泌物中，如唾液、尿液、乳汁、精液等。 目前国内最常用的HBsAg免疫测定方法为酶联免疫吸附试验(ELISA)，其次是放射免疫试验(RIA)。ELISA简单、方便、快速，测定下限进口试剂盒可达0.2 ng/ml，国产试剂盒目前也能达到0.5 ng/ml。 RIA因其试剂半衰期短、废物难于处理等，使用已很受局限。血清HBsAg仅为HBV感染的标志。由于其在血液中多为不含病毒颗粒的空壳，故而不反映病毒有无复制、复制程度、传染性强弱及预后。 2．抗HBs 急性乙型肝炎病人处于恢复期后，随着HBsAg的逐步消失，血清中出现抗HBs。抗HBs是一种中和抗体，其能在体内存在相当长的时间。以HBsAg作为疫苗免疫机体产生的抗HBs，对HBV的感染具有保护性免疫作用。10mIU/m1抗HBs为对HBV具有免疫力的临界水平。低于此值，说明免疫失败。乙肝疫苗接种者，体内血循环中除了抗HBs外，不应出现其它乙肝病毒感染血清免疫学标志物，如抗HBe、抗HBc等。一旦出现除抗HBs以外的标志物，则应视为既往HBV感染。 一般情况下，血清中抗HBs和HBsAg不同时存在，若同时检出，可能为抗HBs产生的早期，或属于不同亚型的HBV感染，或由HBV的S基因变异所致。 3．HBeAg HBeAg为HBcAg的可溶性成份，两者约有75％共同的氨基酸序列，但二级结构不同，各有特异的抗原决定簇，因而在细胞水平其体液免疫应答是不同的。其在血清中的出现时间稍后于HBsAg，一般血清HBeAg阳性者，HBsAg亦为阳性。有研究表明，当乙肝病毒的前核心区发生点突变时，可使得HBeAg无法表达，表现为血清HBeAg或抗HBe测定持续为阴性，但血清HBsAg或HBV DNA可表现为阳性。 HBeAg与病毒Dane颗粒、HBV DNA具有伴随关系，是HBV复制活跃的血清学指标，血清HBeAg阳性说明传染性强。急性乙肝病人血清HBeAg持续阳性3个月以上，则有疾病慢性化倾向。 有时临床实验室可见到HBsAg（－）、抗HBs（+）、HBeAg（+）的模式，则很有可能在病毒编码HBsAg的基因区发生了突变。 4．抗HBe 当血清HBeAg转阴后，可出现抗HBe，两者同时阳性较少见。抗HBe阳性说明病毒复制减少，传染性弱，但并非没有传染性。抗HBe不是保护性抗体，这一点与抗HBs不同。 5．总抗HBc和抗HBc IgM 从机体对HBV抗原的免疫应答来看，最早出现的是对HBcAg的细胞免疫应答(HBcAg的免疫原性最强)，随后才发生对HBcAg的体液免疫应答产生抗HBc。总抗HBc包括抗HBc IgM、IgA、IgG和IgE等。抗HBc IgM可以说是机体感染HBV后在血液中最早出现的特异抗体，在乙型肝炎的急性期呈高滴度，是判断急性乙型肝炎的重要指标。随着急性乙肝的恢复，抗HBc IgM滴度(以及抗HBc IgA)降低乃至消失。如持续高滴度，则常表明病人乙肝有慢性化倾向。研究表明，在慢性活动性乙型肝炎患者血循环中，抗HBc IgM检出率及滴度亦较高，说明HBV在体内复制活跃，是传染性强的指标之一。抗HBc不是保护性抗体。抗HBc在血中呈低滴度且与抗HBs同时存在，是既往感染的标志。 6．乙肝“两对半”检测应用的误区 乙肝“两对半”的临床检测应用极为常见，并且常将不同的阴阳性模式与乙肝患者的临床症状或过程联系起来，有的甚至进行乙肝“两对半”的定量测定，以判断乙肝患者临床治疗的效果。这中间存在对“两对半”结果应用的较大的误区，是对这些病原体感染者体内相应抗原抗体的发生发展以及对疾病状态和抗病毒治疗之间的关系不了解所致。目前针对感染性疾病抗病原体的药物治疗,主要有两类：一是杀灭,如梅毒和结核病的抗菌素应用治疗;二是抑制,如乙肝和丙肝的抗病毒治疗。当治疗有效时，前者表现为病原体的消失，后者表现为病原体数量的动态性降低。因此，与治疗效果密切相关的是病原体的存在与否或存在数量的多少。而抗体，因其是机体对病原体特定抗原成分的特异免疫应答的产物，既使是病原体因抗菌或抑病毒药物的应用已消失或大大减少，其也可能在体内存在相当长的一段时间或持续存在，其与病原体的存在与否或存在数量无正相关关系。也许有同仁要问，那么病原体抗原呢？其不是病原体上的一部分吗？应该说其含量高低与病原体之间有正相关了吧。这要具体情况具体分析。如上面提到的HBsAg和HBeAg就不行，因为HBsAg在乙肝患者血循环中以三种形式存在，即圆形颗粒、管形颗粒和Dane颗粒。其中只有Dane颗粒中存在乙肝病毒，但其仅占所有HBsAg的0.2%，其它绝大部分为空的圆形颗粒和管形颗粒,所以HBsAg和乙肝病毒之间自然就缺乏正相关。而HBeAg通常与乙肝病毒存在之间有很好的正相关,其也是乙肝患者传染性强弱的一个主要血清学指标。按理其应该可以作为乙肝患者抗病毒疗效的观察指标,实际上也有很多人在这样做，但由于乙肝病毒基因组的前C区常易出现点突变，使得HBeAg表达缺失，此时血清HBeAg测定为阴性，但病原体仍大量存在。因此，HBeAg也不能作为乙肝患者抗病毒疗效观察的指标。 在乙肝“两对半”中，真正有定量测定价值的只有抗HBs。但这种测定也不是用于临床乙肝患者疗效观察，而是用于人群乙肝疫苗注射效果的判断；也就是说，当某人注射疫苗后，如外周血中抗HBs定量超过10 mIU/ml，则说明受免疫者具有对乙肝病毒的免疫力，免疫力及持续时间与抗HBs含量高低应成正比。 总而言之，“两对半”结果的实质其实只是机体感染HBV后免疫应答结果的反映，与乙型肝炎的发生和发展过程之间并无必然的联系。因为绝大部分HBV感染者并不出现肝炎症状，而只是表现为携带者，但其同样会有免疫应答的产生，而得到不同的“两对半”结果模式。因此，从根本意义上来讲，“两对半”结果的阳性，反映的只是感染了HBV，与临床病情轻重之间可以说毫无因果关系。 二、HBV DNA测定的临床意义 我们知道,HBV DNA检测是乙肝病毒抗病毒治疗唯一有效的监测指标。目前国内用于HBV DNA定量测定的方法基本上为聚合酶链反应(PCR)，并以外标准作为定量依据。在临床检验中，任何一种临床检验方法对同一份病人标本在不同的测定批次、检测某种指标均有一定的结果差异，不可能完全一样。就象打靶一样，同一个人用同一把枪，枪再准，人素质再高，也是这次打10环，下次就是9.5环，再次又是10.2环，再或又是10环或只有9环。每次差异的多少跟枪和人有很大关系，像奥运会冠军，每枪间的环数差异就小，象普通人，则差异就很大。临床检验也是如此。PCR用于HBV DNA 定量检测，如是使用外部标准进行定量，再加上HBV DNA定量数值大，往往不同测定批次间差异会较通常的检验项目大，一般量值变化在一个数量级内均可视为没有变化。因此，当一个HBV DNA PCR定量检验结果为7.2E+08拷贝/ml（7.2E+08为7.2´108的意思）的乙肝患者，用抗病毒药物（如拉米夫定或干扰素）治疗,两周后，再检测，如结果为5.2E+08拷贝/ml，再两周后，结果为9.0E+08拷贝/ml，检测数据在一个数量级范围内变化，说明结果没有变化，抗病毒治疗无效果。 乙肝病毒的抗病毒治疗效果的判断可以采用PCR方法，动态检测患者血循环中HBV DNA。当患者经抗病毒药物治疗后，HBV DNA含量持续下降，然后维持在低水平，或低至方法能检出的含量（测定下限）以下，则说明治疗有效。观察抗病毒药物治疗效果不能凭两三次检测结果来判断，必须多次动态观察，每次检测的间隔天数不宜太短，一般为两周左右。可采用作图的方法来判断是否有效。如图1的HBV DNA含量动态变化则说明治疗无效，图2变化则为有效。如一急性乙肝患者，HBV DNA PCR定量检测，含量为5.2E+08拷贝/ml，使用拉米夫定进行抗病毒治疗，两周后，HBV DNA含量降为3.2E+05拷贝/ml；又两周后，降为1.8E+03拷贝/ml；再两周后，检测结果为小于1.0E+03拷贝/ml，同时肝功能也恢复正常。也许有人要说，该患者乙肝转阴了，其实不然。因为到目前为止，人类对于病毒仍没有找到有效的杀灭方法，只能是用抑制病毒的药物如拉米夫定等治疗。而HBV一旦感染机体，体内将终身携带该病毒，不可能出现所谓的“转阴”。使用PCR没有检出来，只是说明血液中病毒的含量低于所用方法能检出的量而已。
小知识： 乙型肝炎的抗病毒治疗: 人类对于病毒直到现在还没有找到有效的杀灭方法，仍停留在抑制病毒复制治疗的阶段。α—干扰素（IFN－α）曾被认为是唯一有效的抗病毒治疗药物，但它的适应症有限，疗效较差，不良反应的发生率较高。国外有一些药厂研制了许多核苷类似药物，如拉米夫定、喷昔洛韦或其口服制剂泛昔洛韦、Adefovir及Lobucavir等，其对HBV有较强的抑制作用，在国内以拉米夫定的应用最为广泛。 拉米夫定为口服核苷类似药物，化学全称为2’，3’－双脱氧－3－硫胞嘧啶核苷，简称3TC。因其对逆转录酶的活性具有抑制作用，最先用于艾滋病的抗病毒治疗。3TC抑制HBV复制的作用机理，系药物在细胞内经磷酸化后，由于其与脱氧胞嘧啶核苷（dCTP）类似，因而其可与dCTP竞争而进入合成中的DNA链，进而使DNA不能继续延伸而终止复制。这种终止复制的作用对HBV DNA负链和正链均有效。服用3TC无严重不良反应。但长期服用可产生耐药性。耐药产生的机理系因其多聚酶基因区发生点突变所致。多聚酶C区的亚结构域是HBV进行逆转录的活性部位，由酪氨酸（Y）－蛋氨酸（M）－天门冬氨酸（D）－天门冬氨酸（D）即YMDD组成，是3TC干扰HBV复制的结合位点。当YMDD中的第552位的蛋氨酸可被缬氨酸（V）或异亮氨酸（I）取代，生成 YV552DD或YI552DD，导致亚结构域的空间构型改变，从而阻碍与3TC的结合。YIDD变异可单独存在；而YVDD则常伴有多聚酶B区第528位的亮氨酸（L）由蛋氨酸（M）取代。HBV发生变异后的临床意义不清楚。但3TC长期效果取决于耐药毒株发生率。3TC并非治疗HBV感染的理想药物。除会产生耐药外，3TC只能阻断肝细胞内HBV复制中的反转录过程，对已整合入染色体的HBV DNA毫无影响，并且对染色体外的游离基因模板即共价闭环DNA (cccDNA)也毫无作用。有人提出将3TC与其它核苷类药物或IFN－α联合应用，但效果不会太好。总而言之，目前对于乙型肝炎抗病毒治疗，尚无特效的治疗方法。
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