谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定
发布时间:2013-02-14 来源:文档文库
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谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定
一、实验目的 1.用纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用 2.用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力 3.学习治疗检测SGPT的方法及原理 4.了解检测肝损伤模型的制备及SGPT在科研中的应用。 二、仪器与试剂 1实验材料 动物肝脏 2实验试剂 10.9NaCl溶液 2海砂 31谷氨酸溶液1KOH溶液中和 41丙酮酸钠溶液用1KOH溶液中和 50.1KHCO3溶液 60.025一溴乙酸溶液用1KOH中和 72乙酸溶液 8酚的饱和水溶液将2份酚和2份水按重量计算混合放入分液漏斗中振荡。静止24h以后分层将下部酚层放入瓶中备用。新配制的酚展层剂可以反复使用1周。 90.1水合茚三酮的正丁醇溶液 100.1标准谷氨酸溶液 110.1标准丙氨酸溶液 121KOH溶液 谷丙转氨酶活性的鉴定纸层析法 一、实验原理 观察肌肉糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。为防止丙酮酸被肌肉糜中的其它酶所氧化或还原在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸。 二、实验操作 1.谷丙转氨酶提取液制备2g肝脏0.9NaCL 6mL海砂 200mg在低温下研磨成浆用稀薄的脱脂棉过滤得提取液滤液不清。 2.转氨作用 取试管2支按下表加入试剂加入试剂的单位为mL 试 剂 对照管 测试管 1谷氨酸 0.50 0.50 1丙酮酸钠 0.50 0.50 0.1KHCO3 0.50 0.50 0.025一溴乙酸可不加 0.25 0.25 煮沸
的酶液 0.50 — 酶液 — 0.50 加脱脂棉塞45℃水浴1.5h时时振荡内容物 2乙酸 6滴 6滴 沸水浴2min使蛋白质完全沉下过滤作层析 3.纸层析操作方法 取圆形层析滤纸1张在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆滤纸不可以折通过中心将滤纸绘成四等分扇形。用毛细管点样2-4次直径不超过2mm在滤纸的圆心上剪一小孔直径约1-2mm取一小滤纸条将下端剪成刷状在卷成灯芯插入圆形小孔不能使灯芯突出纸面将圆形滤纸平放在盛有层析液水饱和酚培养皿上使灯芯向下与溶剂接触用大小相同的培养皿盖在滤纸上溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止展层时间为1h80-100℃烘箱干燥喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液80-100℃显色。 三、实验结果 实验 血清谷丙转氨酶活力单位测定 一、实验原理 本实验用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物经转氨作用生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸与24-二硝基苯肼作用生成24-二硝基苯腙此物质碱性条件下呈棕红色其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比可用比色法进行定量测定。通过与标准溶液的比较即可计算出酶的活力单位。 二、实验试剂 11/15mol/L pH7.4的磷酸缓冲液取1/15 mol/L磷酸氢二钠称取Na2HPO4 9.47g或Na2HPO4·12H2O 23.87g溶于蒸馏水中定容至1000mL825mL1/15 mol/L磷酸二氢钾称取KH2PO4 9.078g溶于蒸馏水中定容1000mL175mL混合。 2GPT基质液称α-酮
戊二酸29.2mg2μmol/L及α-DL-丙氨酸1.78g200μmol/L溶于