东师实验4谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定
发布时间：2016-05-06 来源：文档文库
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综合研究性实验四：
谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定
一.实验目的
1.用纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用； 2.用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力； 3.学习治疗检测SGPT的方法及原理；
4.了解检测肝损伤模型的制备及SGPT在科研中的应用。
二.实验材料与试剂
[一]实验材料
动物肝脏
[二]实验试剂
1.9%NaCl溶液 2.海砂
3.1%谷氨酸溶液（1%KOH溶液中和） 4.%丙酮酸钠溶液（用1%KOH溶液中和） 5.0.1%KHCO3溶液
6.0.025%一溴乙酸溶液（用1%KOH中和） 7.2%乙酸溶液 8.酚的饱和水溶液
将2份酚和2份水（按重量计算）混合后，放入分液漏斗中，振荡。静止24h以后分层，将下部酚层放入瓶中备用。新配制的酚展层剂可以反复使用1周。
9.0.1%水合茚三酮的正丁醇溶液 10.0.1%标准谷氨酸溶液 11.0.1%标准丙氨酸溶液 12.1%KOH溶液
二.谷丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法）
[一]实验原理
观察肌肉糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。为防止丙酮酸被肌肉糜中的其它酶所氧化或还原，在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸。
[二]实验操作
（一）谷丙转氨酶提取液制备
谷丙转氨酶提取液制备方法 2g肝脏+0.9%NaCl6mL+海砂200mg
在低温下，研磨成浆
用脱脂棉过滤，得提取液（滤液不清）
（二）转氨作用
试 剂 0.1moL/L谷氨酸 0.1moL/L丙酮酸钠
0.1%KHCO3 0.025%一溴乙酸 煮沸的酶液 酶液
对照管 0.50 0.50 0.50 0.25 0.50 —
测试管 0.50 0.50 0.50 0.25 — 0.50
加脱脂棉塞，45℃水浴，1.5h，时时振荡内容物 2%乙酸
6滴
6滴
沸水浴2min，使蛋白质完全沉下，过滤，作层析
（三）纸层析 1.方法
纸层析方法
取圆形层析滤纸1张，在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆 通过中心将滤纸绘成四等分扇形，用毛细管点样2-4次（直径不超过2mm）
在滤纸的圆心上剪一小孔，直径约1-2mm
取一小滤纸条，将下端剪成刷状，在卷成灯芯插入圆形小孔，不能使灯芯突出纸面 将圆形滤纸平放在盛有层析液（水饱和酚）培养皿上，使灯芯向下与溶剂接触
用大小相同的培养皿盖在滤纸上
溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层，直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止（展层时间为1h）
80-100℃烘箱干燥，喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液，80-100℃显色
2.实验结果
三.血清谷丙转氨酶活力单位测定
[一]实验原理
本实验用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，经转氨作用生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成2，4-二硝基
苯腙，此物质碱性条件下呈棕红色，其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比，可用比色法进行定量测定。通过与标准溶液的比较，即可计算出酶的活力单位数。
[二]实验操作
（一）标准曲线的绘制 1.试剂
（1）1/15 mol/LpH=7.4的磷酸缓冲液
取1/15 mol/L磷酸氢二钠（称取Na2HPO4 9.47g或Na2HPO4·12H2O23.87g，溶于蒸馏水中定容至1000mL）825mL；1/15 mol/L磷酸二氢钾（称取KH2PO4 9.078g溶于蒸馏水中定容1000mL）175mL混合。 （2）GPT基质液
称α-酮戊二酸，29.2mg（2 mmol/L）及 