密度梯度离心法

骨细胞的培养及其操作

原代培养：

密度梯度离心法：

1. 取鼠龄２个月，体重70-120g的白鼠２只

2. 将白鼠颈椎脱臼处死，浸入盛有３００—５００ｍｌ　７５％酒精的１０００ｍｌ烧杯中浸泡５ｍｉｎ

3. 用镊子取出后用脱脂棉擦掉多余酒精，置于培养皿内，用手术剪剪开大腿内侧皮肤和肌肉，分离出股骨和胫骨，沿肌肉白线处清除其周围的肌肉，在培养皿中用５－１０ｍｌ７５％酒精浸泡５ｍｉｎ后移入超净工作台；

4. 用镊子夹住大鼠股骨和胫骨放置于无菌的培养皿上方，依次用3-5ml PBS和无血清的培养基冲洗2-3次后，移入另一无菌培养基中，用镊子和骨钳固定股骨，分别用10ml注射器在骨两端钻孔。

5. 用5ml注射器吸取培养基从骨一端孔处插入，从上至下缓慢冲洗骨髓腔，用下方的无菌培养皿收集骨髓悬液，重复此过程2-3次。

6. 在15ml离心管中加入15mlFicoll 分离液，再将骨髓悬液沿管壁缓缓加入其上，注意一定要轻缓，不能让骨髓悬液与分离液相混合，调整骨髓悬液与分离液的体积比为2：1.

7. 将离心管以2000rml离心20min离心后管内物质分为3层，用吸管小心吸取中间的白膜层置于一个新的离心管内；

8. 在此离心管中加5ml培养基，吹打成单细胞悬液，1000rml离心5min,离心后用吸管吸取上清液并去掉，完全培养基，并轻轻吹散细胞10-20次，制成细胞悬液。

以5*10^6cell/ml的细胞密度接种于T25培养瓶中（培养瓶中培养基终体积为5ml）,置于CO2培养箱中培养，48小时后用吸管吸出全部培养液并去掉，添加新鲜培养液，以后每隔三天全量换液一次。

全骨髓培养法

1）-5）同“密度梯度离心法”；

6）在15ml离心管中3ml培养基，再将骨髓悬液用吸管沿管壁缓缓加入其中；

7）将离心管以1000rpm离心5min,离心后用吸管吸取上清液并去掉，加入完全培养基轻轻吹散细胞10-20次，制成细胞悬液。

8）以5*10^6cell/ml的细胞密度接种于T25培养瓶中（培养瓶中培养基终体积为5ml）,置于CO2培养箱中培养，48h后用吸管吸出约一半培养液（约2.5ml）并去掉，添加2.5ml新培养液，以后每隔三天全量换液一次。

传代培养

1) 在超净工作台内用吸管吸取T25培养瓶的旧培养液 ，加入3-5毫升PBS冲洗2-3次，吸去PBS然后加入1ml消化液(0.125% 胰蛋白酶+0.02%ＥＤＴＡ)；

2) 倒置显微镜下观察贴壁细胞形态变化，当贴壁的剑充值细胞质回缩，细胞间隙不断增大，细胞呈近球形同时有少量圆形细胞脱壁时（３７℃下整个消化过程大约需3-5min），立即加入2ml(两倍消化液体积)完全培养基（含10%ＦＢＳ的ＤＭＥＭ）终止消化。

3) 用吸管反复有序轻轻吹打瓶壁上的细胞，使细胞脱离瓶壁后成单细胞悬液，显微镜下观察细胞全部脱落后，将单细胞悬液用吸管移至15ｍｌ离心管中，1000rpm离心5ｍｉｎ。

4) 离心后，用吸管吸取上清液后去掉，加入适量培养液，轻轻吹打细胞10-20次按1:2传代培养，每三天换液一次。

5) 显微镜下逐日观察传代培养的细胞，带贴壁细胞达到90%以上融合时，再进行传代操作，如此反复。

冷冻步骤

1） 按传代方法将消化好的细胞离心（１０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ），吸管吸取上清后去掉，加缓慢加入配置好的冻存液。

2） 用吸管轻轻吹打１０－２０次制成单细胞悬液，分装入冻存管中，调节冻存管中细胞的终密度为10^6－10^７ｃｅｌｌｓ/ｍｌ，每管细胞悬液体积为１－１.５ｍｌ；

3） 冻存管预先用记号笔做好标记，包括细胞名称，细胞代数，冻存日期，操作人；

4） 先将东村官放入４℃冰箱中１５－２０ｍｉｎ，然后转移至异丙醇冻存盒内置于　－８０℃冰箱中过夜，然后将冻存管移入液氮罐中保存。

冻存液：５％DMSO+95%培养基

复苏步骤

1） 从液氮中取出冻存管，迅速放入37℃水浴，不断摇动1-2min使其尽快融化

2） 用酒精棉球擦洗冻存管以减少污染；

3） 预先在15ml离心管中加入5ml预热的培养基，吸出冻存管中的细胞悬液，注入离心管中，离心（100rpm,5min）

4） 用吸管吸取上清液后去掉，加入5ml新鲜培养液吹打10-20次制成单细胞悬液；

5） 接种至T25培养瓶中

6） 放入培养箱中培养

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/b606b04027284b73f2425068.html