题目：叶绿体色素定量测定及理化性质鉴定
一、实验原理
1、叶绿体色素定量测定
植物叶绿素在红光区有最大吸收值，因此，利用分光光度计测定其在特定波长下的吸光值，然后利用朗伯-比尔定律计算叶绿素含量。
根据郞伯-比尔定律，当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质（稀溶液）时，其吸光值A与吸光物质的浓度C及吸收层厚度d成正比，及A=KCd。
如果溶液中含有数种吸光物质，则混合液在某一波长下的总吸光值等于各组分在此波长下吸光值的总和。如欲测定叶绿素混合提取液中叶绿素a、b、叶黄素、胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在3个特定波长下的吸光值A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a、b分别663nm和645nm（80％丙酮提取）有最大吸收值；同时已知在波长663nm下，叶绿素a、b吸收系数分别为82.04和9.27；在波长645nm下分别为16.75和45.6；在有叶绿素存在的条件下，用分光光度计法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量，其推导公式如下：
A663= 82.04 Ca+ 9.27 Cb；
A645 = 16.75 Ca+ 45.6 Cb；
Ca= 12.21 A663-2.81A645；
Cb= 20.13 A645– 5.03 A645；
Cx·c=word/media/image1.gif
式中，Ca、Cb和Cx·c分别为叶绿素a、b和类胡萝卜素的浓度。
2、叶绿素理化性质鉴定
叶绿素是一种双羧酸，其中一个羧基被甲醇所酯化，另一个被叶醇所酯化。故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿素的盐。皂化反应如下：
叶绿素分子吸收光量子后转变激发态后很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿体含卟啉环，卟啉环中的镁原子可被氢离子、铜离子、锌离子所置换。用酸处理叶片，氢离子进入叶绿体后置换镁原子，形成去镁叶绿素，使叶片呈褐色。而去镁叶绿素中的氢离子，易被铜离子取代，形成稳定的蓝绿色铜代叶绿素。
二、实验仪器和试剂
1、实验仪器：分光光度计，研钵，剪刀，50mL容量瓶，玻璃棒，小漏斗，滤纸（小），5mL移液管，洗耳球，胶头滴管，10mL试管，试管夹，酒精灯。
2、实验试剂：80％丙酮，纯丙酮，碳酸钙，20％KOH甲醇溶液，苯，0.5molmol/L HCl，醋酸铜粉末。
三、实验材料
新鲜菠菜叶；
干菠菜叶粉末。
四、实验步骤
（一）叶绿体色素定量的测定
1、称取新鲜菠菜叶样品0.1g，放入研钵中，加少量碳酸钙和纯丙酮研磨；研磨较充分时，再加10mL的80％丙酮，继续研磨至成匀浆。
2、取一张小滤纸，折叠后放入漏斗中，并用80％丙酮湿润，使滤纸紧贴壁。然后将提取液滤入50mL容量瓶中，用少量丙酮冲洗研钵及研锤数次。
3、用胶头滴管吸取80％丙酮，缓慢冲洗滤纸上的残留叶绿素，将其全部洗入量瓶内，最后用80％丙酮定容至50mL。
4、在分管光度计上，分别测定663nm，645nm和470nm处的吸光值，以80％丙酮为空白对照。
5、结果计算
按原理中的公式分别计算叶绿素a、b和类胡萝卜素的浓度（mg/L），即：
Ca= 12.21 A663-2.81A645；
Cb= 20.13 A645– 5.03 A645；
Cx·c=word/media/image1.gif
再按下式计算组织中各色素含量（用mg/g鲜重表示）：
叶绿体色素含量（mg/g）= word/media/image5.gif
（二）叶绿素理化性质的鉴定
1、皂化作用
a.吸取叶绿体色素提取液约5mL放入试管中，再加入5mL20％的KOH甲醇溶液，充分摇匀，然后加入苯，摇匀。
b.沿试管壁慢慢加入1.5mL蒸馏水，轻轻混匀，与试管架上静置，观察其现象。
2、叶绿素取代反应
a.取两支试管，向一支试管中加入5mL叶绿体色素提取液，然后将其一部分倒入另一支试管中，作为对照。向试管里加入1~2滴0.5mol/L HCl后摇匀。
b.将加了HCl的叶绿素溶液倒出一部分置于另一空试管中作对照，然后向管内加入四分之一勺左右的醋酸铜粉末，慢慢加热，然后置于试管架上，过段时间后观察其现象。
3、荧光现象
取干菠菜粉末约1g，加入5mL80％丙酮，等待一会儿，用灯光照射试管，观察其在反射光和投射光下的荧光颜色。
五、实验结果
六、思考题
1、测定植物叶片叶绿素含量有什么意义？
答：意义：植物叶片叶绿素含量与光合速率、营养状况等密切相关，对叶片中叶绿素含量进行测定，可以了解物质转化的速度和程度。在作物栽培上，通常测定叶绿素含量以表征植物生长状况，也往往把叶色变化作为看苗诊断和肥水管理的重要指标，同时有利于了解作物生长状况，发现存在的问题，改良栽培方式，提高产量，这对于农业生产有很大的现实意义；在水体治理中，通过测定叶绿素含量，了解水中植物的光合能力，借此寻找治理方案。总之，测定植物叶片叶绿素含量对于我们生产实践具有重大意义。
2、测量出叶绿素含量偏低，可能是因为什么？
答：（1）选取的叶片比较嫩，叶片内叶绿素含量较低；
（2）取材时，取到含叶脉较多或大叶脉的部分，而叶脉内不含叶绿体；
（3）实验过程中，在过滤一步中，未用丙酮洗研钵或未清洗滤纸；
（4）研磨不充分，导致叶绿素未完全析出；
（5）实验过程中叶绿素析出后在光下时间较长（研磨时间过长），导致叶绿素分解；
3、正常叶绿素a：叶绿素b的比值约为3:1，测出该比值偏低，可能原因是什么？
答：（1）植物若经过遮光处理，叶绿素a向叶绿素b的转化加快，叶绿素a水解形成脱植基叶绿素a，脱植基叶绿素a再转化为脱植基叶绿素b，最后合成叶绿素b，从而降低了叶绿素a/b的比值；
（2）若植物是阴生的，弱光下叶绿素b的相对含量增高是有其生理适应，有利于对弱光的利用，因此其比值也会偏低；
（3）该比值还与叶龄有关，如果是老叶，Mg会输向新叶新叶输送，老叶中叶绿素含量会降低，且叶绿素a的下降速度更快，从而导致叶绿素a/叶绿素b的之偏低。
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