实验一底物浓度对酶促反应的影响[参照模板]

实验一 底物浓度对酶促反应的影响

1、实验目的

掌握底物浓度对酶活性的影响，了解碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AKP）的Km值的测定原理和方法，理解Km值的意义。

二、实验原理

在温度、pH及酶浓度等恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。当底物浓度较低时，酶促反应速度V随底物浓度[S]的增高而显著加快，随着底物浓度渐高，反应速度加快程度渐小，当底物浓度增加到一定程度以上时，再增高底物浓度，反应速度亦不再增加，成为该条件下极限最大反应速度Vmax。底物浓度与反应速度的这种关系可以用下列米－曼（Michaclis-Menten）氏方程式表示。

V=8bfb48d9332827ab14374b186d9118fb.pngd41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e.png或Km=[S](2947ce3b24ae02377fcb19ee48648fb3.png — 1)

式中，Km为米氏常数。当V=Vmax/2时，则Km=[S]，即米氏常数是反应速度等于最大速度一半时底物物浓度的数值。如图所示：

word/media/image4.gif [V]

Vmax

f4f54805d18f80bc75da836e66dcbce6.png

Km [S]

图1 底物浓度与酶促反应速度的关系

Km是酶的特征性常数，不同酶的Km值不同，同一酶作用于不同底物的Km值亦不同。大多数纯酶的Km值在0.01～100mmol/L之间。Km值的测定在酶学研究中有重要的实际意义。

根据实验结果绘制上述直角双曲线，难以准确求出Km和Vmax值。而用米曼氏方程式的下列变换式，则容易求得Km及Vmax值。

米曼氏方程式中各项皆采用倒数表示，则成为Lineweaver—Burk氏方程式：

a19577d226c2438f01e9188c0d96fd00.png=301651d56051784b5279a5e3864445b2.png·54aeecd98536aaf185bf8cb90957595b.png+16d59da0b096cd35e9bb148ab990ddd6.png

如图所示：

word/media/image10.gif a19577d226c2438f01e9188c0d96fd00.png

斜率=301651d56051784b5279a5e3864445b2.png

word/media/image13.gif

图2 Lineweaver—Burk氏法作图求Km值

这是个上截式直线方程式。a19577d226c2438f01e9188c0d96fd00.png与78bcdd44f4cdd746a8231d7c1515d7eb.png为直线关系，如上图。直线斜率为301651d56051784b5279a5e3864445b2.png，纵轴截距为16d59da0b096cd35e9bb148ab990ddd6.png，横轴截距为－98b643c80707f1c396ca21c45d6c14d6.png.据此可以测定不同浓度底物的反应速度，按a19577d226c2438f01e9188c0d96fd00.png与78bcdd44f4cdd746a8231d7c1515d7eb.png关系作图而容易正确得出Km值。

另有其他变换式，例如把上式两侧皆乘以[S]，则转换成Wilkinson氏方程式。

e126fed1cd1e631db2262cad23da5171.png=301651d56051784b5279a5e3864445b2.png+16d59da0b096cd35e9bb148ab990ddd6.png·[S]

word/media/image21.gif如图所示：

e126fed1cd1e631db2262cad23da5171.png

斜率=16d59da0b096cd35e9bb148ab990ddd6.png

301651d56051784b5279a5e3864445b2.png

-K m [S]

图3 Wilkinson氏法作图求Km值

这也是直线方程式。以e126fed1cd1e631db2262cad23da5171.png为纵轴，[S]为横轴作图，则直线在横轴上的截距为－Km.

本实验利用磷酸苯二钠法测定不同浓度底物的碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AKP）的反应速度，作图求出Km值。

AKP的催化原理为：在一定pH和温度下，待测液中的AKP作用于基质液中的磷酸苯二钠，使之水解释放出酚。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林(AAP)作用并经铁氰化钾氧化，生成红色醌类化合物。以酚作标准液同样处理显色进行比色，可测知酚的生成量，从而计算出酶的活力。

三、实验器材

试管、37℃水浴锅、可见分光光度计、座标纸。

四、实验试剂

1、0.04mol/L基质液

称取磷酸苯二钠 2H2O 10.16g，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并稀释至1000mL。加4mL氯仿防腐贮于棕色瓶中冰箱保存，可用一周。

2、0.1mol/L pH10碳酸盐缓冲液（含0.3% 4-氨基安替比林）

称取4-氨基安替比林（AAP）3g，用0.1mol/L pH10碳酸盐缓冲液溶解并稀释至1000mL，放棕色瓶内，冰箱保存。

3、酚标准液（1mg/mL）与酚标准应用液（0.1mg/mL）

word/media/image26.gif酚标准液（1mg/mL）：称取结晶酚1.0克溶于0.1N盐酸至1000mL。

②酚标准应用液（0.1mg/mL）：准确吸取酚标准贮存液（1mg/1mL）10.0 mL于100mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，贮存冰箱中可保存一个月。

4、0.5％铁氰化钾溶液

称取5g铁氰化钾和15g硼酸，分别溶于400mL蒸馏水中，溶解后两液混合，再加蒸馏水至1000mL，置于棕色瓶中暗处保存。

5、0.1mol/L pH10碳酸盐缓冲液(37℃时)

称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g溶解于蒸馏水中，稀释至1000mL。

6、0.01mol/L pH8.8 Tris缓冲液

称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.1g，用蒸馏水溶解并稀释到1000mL，此即为0.1mol/L Tris溶液。取上液100mL，加蒸馏水约700mL，再加0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后用１%醋酸调pH到8.8，用蒸馏水稀释至1000mL。

7、酶液

AKP（10mg，10U/mg）用0.01mol/L Tris缓冲液稀释成每mL含0.7—1.0单位的酶溶液。

五、实验操作

取干净试管8支，编号，按下表操作。特别注意准确吸取酶液、基质液及标准液。

摇匀37℃，保温5min

充分摇匀，37℃准确保温15min

以B管调零，读记在510nm处的各管光密度值OD，并填入下表，计算有关数据并作图。如按林贝氏法可如下进行：

列表并计算记入各有关数据。

底物浓度对酶促反应的影响

(1) 计算出各管的酶活性单位ODt/ODs×0.01，此数代表反应速度（V）。

(2) 计算出各管底物浓度：基质液浓度×2881226a57917cf757598b828691b7dc.png=0.04×903dbe91e8997cbc93fa09477b3138d1.png

(3) 进一步计算出各管的1/V及1/[S]值。

作图：以1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，在方格坐标纸上准确画出各管坐标点，连接各点画出直线，向下延长线与横轴交点为-1/Km值。计算出Km值。

六、思考题

联系实验结果，讨论底物浓度对酶促反应的影响。

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/89e18147cd84b9d528ea81c758f5f61fb6362854.html