分光光度计测核酸蛋白时A260A280 和 A260A230 的含义以及注意的问题

发布时间：2018-08-10 10:55:00 来源：文档文库

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分光光度计测核酸蛋白时A260/A280 和 A260/A230 的含义

（一）

1、A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为 0.1 至 1.0。如果不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；如果吸光度小于 0.05，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响。 DNA 样品的 A260 吸光度值是否>0.1。（请注意，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大于 0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值<0.1）

2、A280nm 是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯 DNA 的 A260/A280 比值为 1.8，纯 RNA 为 2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5 相当于 50％蛋白质/DNA 溶液

3、A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯 DNA 和 RNA 的 A260/A230 比值为 2.5。若比值小于 2.0 标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。A230 产生负值主要是由于在很低 DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230 的负值会被校正。

4、 A320nm 或 A340nm 为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近 0.0。如果不是，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。纯样品的 A320 一般是 0。

5、A260/A280 和 A260/A230 是核酸纯度的指示值，纯度好的 DNA，在 pH7-8.5 下其比值应该在 2.0 或 2.5，A260 / A280 的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是 280 nm。纯净的样品比值大于 1.8（DNA）或者 2.0（RNA）。如果比值低于 1.8 或者 2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。 A230 是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，较纯净的核酸 A260/A230 的比值大于 2.0 。

6、A280 是蛋白质的吸光度。纯净的 DNA 和 RNA 在 A260 和 A280 都有吸收值，但以 260 最高。而核酸提取过程中最主要的污染物蛋白质在 A280 处有强烈的吸收值，所以计算这两个吸收峰的比值就可以确定核酸的纯度。DNA 的这个值一般是 1.8～2.0，而 RNA 则是 2.0。值得注意的是，这个比值并不能很好的反应出核酸的纯度，简单来说寡聚核酸会造成 A260 值升高，如果核酸有降解，则会导致 A260/A280 值上升。另外，如果 A280 值偏高，并不一定是蛋白污染。蛋白在 A280 有吸收值是因为其苯丙氨酸等氨基酸残基中所含有的苯环的缘故，所有含苯环的化合物都会在 A280 有吸收峰。所以如果 A280 升高虽然有最有可能是蛋白污染，但也有可能是其他苯环物质。如植物 DNA 提取过程中的多酚类物质污染。另外，如果要求高的话，我们还会要求测量 A230 的值，正常情况下，核酸的 A260/A230 和 A260/A280 是一致的，如果这个值上升则样品可能会含有多糖类的污染。

（二）

A280nm, A270nm 是蛋白最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯 DNA 的 A260/A280 比值为 1.8，纯 RNA 为 2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5 相当于 50％蛋白质/DNA 溶液.酚的最大吸收峰在 270nm。

A230nm 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估： DNA 和 RNA 的 A260/A230 纯比值为 2.5。若比值小于 2.0 标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。 A230 产生负值主要是由于在很低 DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230 的负值会被校正。

A320nm 或 A340nm 为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近 0.0。如果不是，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。纯样品的 A320 一般是 0。

A260/A280 和 A260/A230 是核酸纯度的指示值。纯度好的 DNA 或 RNA， pH7-8.5 下 A260 / A280 的比值应该在 2.0 或 2.5。在纯净的样品比值大于 1.8（DNA）或者 2.0（RNA）。如果比值低于 1.8 或者 2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、盐（胍盐）等，较纯净的核酸 A260/A230 的比值大于 2.0 。当 0.5％BSA 蛋白质污染时，蛋白污染会导致 260 和 280 的数值都下降，其净结果是 260/280 比值下降， 260/280 的比值变化并不显著，但正如分子克隆3所说。但蛋白残留会导致 230 的数值显著上升，显著影响 260/230 的比值。也就是说，如果 RNA 样品的 260/280＝1.7，260 /230＝0.5，那么就应该考虑污染原因不是胍盐残留，而是蛋白残留. 酚的最大吸收峰在 270。酚的残留会显著的增加 230、260 和 280 的数值，同时酚的吸收峰与核酸的吸收峰合并后，最大吸收峰向 270 方向偏移，也就是说最大吸收峰在 270 附近。也就是说，如果 RNA 如果样品的 260/280=1~1.5, 260/230=1~1.5，那么污染原因就应该考虑是酚残留。那么污染原因就应该考虑是酚残留。胍盐对 RNA 样品吸收有显著影响，会在小于 230nm 处产生大的吸收峰。胍盐残留不会影响 260 和 280 的数值，对 260/280 的比值不会造成大的影响，当然也不影响 RNA 定量。但胍盐残留对 260/230 比值具有明显影响。例如本例中 260/230 的比值小于 0.21 时，260/280 的比值还>2。也就是说，如果 RNA 如果样品的 260/280>=2，260/230<1，那么污染原因就应该考虑是胍盐残留，那么污染原因就应该考虑是胍盐残留。其他：用分光光度计测量 RNA 时，用水而不是用 TE 缓冲液稀释 RNA 样品会造成 A260/A280 比值下降。原因是低离子强度和低 pH 溶液会增加 280 nm 处的光吸收值。那样就很容易被蛋白污染，加氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多，那样就很容易被蛋白污染所以现在一般取 400ul左右。当 260/230<1 时，只有两种情况。一是胍盐污染，二是蛋白污染。