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狂犬病的病原学

发布时间：2010-12-05 06:10:11 来源：文档文库

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狂犬病的病原学

一人类探寻狂犬病病原的历史

狂犬病是一种历史悠久而令人恐怖的疾病,主要经由疯动物咬伤而传播.事实上,和鼠疫,天花,流感等曾造成人口大批死亡,对人类历史进程发生重大影响的传染病相比,狂犬病对历史的影响可以说是微乎其微,人类受害者的数目从未引起人口统计上的重大改变.但该病的惨痛的临床过程,一旦发病就不可避免地导致死亡的悲剧结局,长久以来在中外学者,文人的笔下都获得特殊的关注. 狂犬病的症状和传播途径特别典型,不易与其他疾病混淆.世界上有关病毒病在历史上发生情况的最明确可靠的记载以有关狂犬病的记载为最早.

国外关于狂犬病的最早历史记载

1. 世界上关于狂犬病的最早记载见于距今4300年以前美索不达米亚(古王国,在今伊拉克境内)的埃什努纳(Eshnunna)法典,其中有关于狂犬咬人致死后犬的主人应如何赔偿的具体规定.这说明当时已对狂犬病的病因,传播特点和预后有明确的认识.古代诗人和哲学家的记述在荷马史诗《伊利亚特》(公元前6世纪) 中,在古希腊哲学家德谟克利特(公元前400年)和亚里士多德(公元前322年)的著作中,都有关于狂犬病的明确记述.

罗马帝国鼎盛时期及以后罗马帝国鼎盛时期(公元一世纪)的名医塞尔萨斯在实践中对被疯狗咬伤的伤口用腐蚀剂,拔火罐,烧灼和吮吸等方法来进行处治.随后古希腊名医盖仑(约130～200)还用截肢术治疗狂犬病.对被狂犬咬伤的伤口及时进行冲洗,清创和消毒是减少发病的有效措施之一.

狂犬病毒(RV)从伤口向中枢神经系统传播较慢.动物实验证明,在小鼠足垫接种病毒后,4小时内切断接种肢,可使动物存活,晚了动物就死亡.在将近两千年前无有效的特异治疗的情况下,以截肢的高昂代价来换取无价的生命,仍不失为一种明智的选择.19世纪以前,对狂犬病病因的认识总的来讲是盲目的,甚至常常是荒谬的. 对病因的解释:极端的燥热;干旱;性挫折;心理过度紧张等;而 "魔鬼附身" 似乎是更容易被一般人接受的一种解释.

狂犬病人的典型特征是极想喝水但又极端 "恐水" (狂犬病又称恐水病),所以古代的治疗方法之一就是将病人出其不意地扔入池塘,认为这样可以使病人对水的饥渴和恐惧同时消除.处治狂犬病的其他方法:用盐或炽热的烙铁处理伤口;用狗头焚烧的余灰敷伤口;服用獾,杜鹃和燕子粪的煎汁以及各种 "魔水" 等.

2.我国古代在狂犬病防治方面的成就

中国古籍中有关狂犬病的最早记载见于著名史书《左传》,其中记有"(鲁)襄公十七年(即公元前556年)十一月甲午国人逐瘈狗."这说明我国在2500年前就已有疯狗(即狂犬病)存在,而且已认识到这类疯狗对人危害极大,并采取了有效的措施:驱逐疯狗.

我国现已发现的最早的医方书《五十二病方》

我国现已发现的最早的医方书《五十二病方》中有治 "狂犬啮人" 和"犬啮人" 各三方,其中有一种外治方是 "犬所啮,令毋痛及易瘳方",具体治法是 "令(啮)者卧,而令人以酒财沃其伤." 即被狗咬伤后,采用酒剂冲洗伤口.

《五十二病方》是从长沙马王堆汉墓出土,系由一人手抄在高约24厘米的半幅帛(丝绸)上.据考证《五十二病方》成书年代当在公元前5—6世纪,所以中国为预防狂犬病而采用基本正确的伤口处理方法比欧洲可能要早500年以上.

我国晋代著名医学家葛洪的《肘后方》

我国晋代著名医学家葛洪在《肘后方》(约公元303年)卷七谈到识别狂犬病的方法,认为该病 "过三七日不发则免也,要过百日乃为大免."这与现代的统计资料大体相符 (不过狂犬病的潜伏期有少数超过百日,有约1%甚至在1年以上).该书中还提到以狂犬脑组织外敷伤口作为防治措施,虽未具体指明对狂犬脑组织如何减毒,其疗效也无从肯定,但这种基于 "以毒攻毒" 思想的疗法,已具有主动免疫思想的萌芽,对我国早在十世纪时发明用"人痘法"预防天花可能有积极影响.

狂犬病的起源

综合各国的历史资料看,狂犬病的发源地可能在东半球的亚洲或欧洲.而西半球的狂犬病很可能是在18世纪由欧洲传入的.在南美直到1803年才在秘鲁发现犬狂犬病.

狂犬病控制史中的六个里程碑

人类对狂犬病进行有效的预防和控制的历史还只有一百多年,其中以下六件大事构成了六个里程碑:

里程碑之一

1885年,法国微生物学家巴斯德等在对狂犬病毒(RV)的本质还不了解的情况下,在实践中摸索出了生产狂犬病疫苗的方法,为从根本上解决狂犬病的预防和控制奠定了基础.用疫苗来预防病毒性疾病,除了天花疫苗外,狂犬病疫苗是最早成功应用的一种,由此开创了现代疫苗学的新纪元.

里程碑之二

1903年,意大利医生内基在感染的神经细胞内发现狂犬病毒(RV)包涵体——内基氏体,可用于狂犬病的早期诊断研究.

里程碑之三

1940年代开始将有效的狂犬疫苗大量应用于狗,从而显著降低了人狂犬病的发病率,促进了更多的无狂犬病国家和地区的产生.

里程碑之四

1954年,在人的狂犬病免疫程序中增加免疫抗血清,可进一步提高被狂犬严重咬伤者的存活率.

里程碑之五

1958年成功地使RV适应于在细胞培养中增殖.随后利用该技术生产的细胞培养疫苗在安全性和效力上都更日臻完善,已在欧美和中国等国家普及.

里程碑之六

近十年来用基因工程技术生产的新型口服重组疫苗(如痘苗—RV糖蛋白重组疫苗)已在实验动物中证明是极有效和方便的疫苗,并且已在欧美的野生动物中大规模试用.这类新型疫苗可望为彻底根除狂犬病提供新的有力武器.

二狂犬病毒(RV)的形态和结构

1962年Almeida等发现RV呈子弹状,1970年国际病毒命名委员会正式将RV确定为弹状病毒科(Rhaboviridae)，

狂犬病毒属(Lyssavirus).弹状病毒科的命名主要根据病毒形态似子弹或杆状.

目前本科的正式成员和可能成员有100个以上.本科分三个属,水疱性口炎病毒属(Vesiculovirus,VSV),西格马病毒属(Sigmavirus)和狂犬病毒属.此外还有些未定属的植物弹状病毒.

RV的基因组

不分节段的单股负链RNA,大小为12kb左右,参与编码五种已知的结构蛋白.

这五种蛋白对应的基因为N,NS(M1),M(M2),G和L.不同毒株中各个结构基因的核苷酸长度除G,M和L 外皆相同.每个基因均由3'非编码区,编码区和5'非编码区三部分组成.RV的基因结构与弹状病毒家族其他成员的基因结构基本相似.

RV的基因结构示意图:

三 RV的5种结构蛋白及其基本功能

RV的5种结构蛋白序列主要是由其编码基因的核苷酸序列推导出来的.

1. 核蛋白(N)

皆由450个氨基酸组成.在各病毒株之间有高保守性,同一血清型内不同毒株的同源性在98%到99.6%之间.存在两个高度保守的区域,位于64—105位氨基酸和201～329位氨基酸,而后者又可分为两个更保守的区域210—242位氨基酸和271—317位氨基酸.如同其他弹状病毒的N一样,RV N的羧基端含有大量碱性氨基酸.

功能:

①与RNA结合成核糖核酸蛋白(RNP),保护RNA免遭核酸酶的破坏.

②使RNA所处的核衣壳维护转录所需要的螺旋对称结构.

2. 磷蛋白(NS)

NS其实并不是非结构蛋白,由于人们已习惯称其为NS,在此仍沿用NS之称.鉴于NS结构的一个重要特点是磷酸化,所以亦称为磷蛋白.又因为它是衣壳基质蛋白,也有称其为M1. NS肽链长297个氨基酸残基,序列特点为酸性氨基酸含量高,在肽链中心部分及N端各有一个疏水区.各株系之间的同源性在92%—98%.

功能:

NS的N末端和C末端部位参与结合RV核蛋臼,而且这种结合并非以相互依赖的方式进行.

由于NS的N末端的酸性特点,新生的NS可与N相互作用进而阻止N的聚合,这样NS蛋白就使N维持其功能状态,以包裹新合成的RNA成核衣壳.

3. 基质蛋白(M)

M亦称M2,是RV结构蛋白中最小的蛋白质,其肽链长202个氨基酸残基,为RV五种结构蛋白中变异较大的蛋白质.ERA/CVS株间的氨基酸序列同源性为92%,ERA/PV株间的同源性为95%.

功能:

在核衣壳和病毒包膜之间,起着将两者连接在一起的作用,而且糖蛋白的羧基端插入其中,所以它可以直接影响糖蛋白在病毒包膜表面的构型.

4. 糖蛋白(G)

多肽前体序列由524个氨基酸组成.前19个氨基酸构成疏水性的信号肽,在转录过程中信号肽被切除后,成为成熟的G.成熟的G为505个氨基酸的多肽.如同VSV的成熟G一样,RV的成熟G也分成三个区域:

①膜外区即抗原区(1—439位氨基酸),位于病毒颗粒包膜的表面.

②穿膜区即跨膜区(440-461位氨基酸),有22个氨基酸组成为连续性疏水区,它与G固定在病毒双脂膜上有关.

③膜内区,亦称附着区(462-505位氨基酸),由44个氨基酸组成的羧基末端,定位于病毒包膜内表面,是提供M和N相互作用的位点.成熟G相对分子质量为56kD,等电点为6.7.

糖蛋白(G)

各固定毒株G的氨基酸的同源性有差异,同源性最低的是aG/CVS为87%,同源性最高的是SADB19/ERA为99.4%.穿膜区和膜内区在不同地方株中差异较大(同源性50%-60%),相对而言,膜外区的保守性略高些(同源性≥90%).

功能:

G具有诱导并结合病毒中和抗体,刺激特异性T淋巴细胞增殖,决定毒力等特性.

5. 依赖RNA的RNA多聚酶(L)

L是RV中最大的结构蛋白,不同毒株L的ORF不完全相同.L一级结构的明显特点是存在2个疏水区,位于851-869位氨基酸和1962-1980位氨基酸残基处,它们可能参与N和NS的相互作用.1552-1634位氨基酸区段为一亲水区.

功能:

L是一多功能酶,在病毒基因组复制,转录及转录后加工,包括甲基化带帽和多聚腺苷酸化等方面发挥作用.

四 RV的感染特点

RV一般是通过破损的皮肤或黏膜进入人体的.RV在体内典型的感染过程是由唾液中带有RV的疯动物咬伤,使病毒从伤口侵入机体内.在侵入部位一般不增生,也不侵入血液,故无病毒血症.RV从侵入局部进入周围神经组织内,沿着神经向心传递至中枢神经系统.病毒运行,扩散过程的长短与潜伏期有关,一般为20-60天或更长或更短,这与病毒侵入部位和数量有关.在此过程中,若对机体进行疫苗接种,提高机体的抗感染能力,则可预防发病.

RV的感染特点

一旦RV进入中枢神经,侵犯脑和脊髓的神经细胞,并大量增生,则引起神经细胞功能紊乱和退行性病变,机体开始出现症状.一旦发病,目前尚无法医治.

RV在脑神经细胞中大量增生后,通过传出神经离心性地向外扩散到周围神经及其所支配的组织中,从而引起广泛的非神经组织的感染.常累积于唾液腺,病毒大量增生而由唾液腺排除体外.一般出现典型的狂犬病症状后一周内死亡.

五 RV对理化因子的抵抗力

对温度的抵抗力很弱,在高温下很不稳定. 病毒悬液在56.C,30分钟或60.C,10分钟即可灭活.煮沸2分钟,病毒全部死亡.保留在机体组织内的病毒加温灭活的时间要延长些.含有RV的脑组织在常温下可保存活力7-10天,在日光和紫外线照射下,或强酸,强碱的环境下,病毒灭活的时间会缩短.RV在pH 7.4-8.0较为稳定,若pH超过7-9的范围,则病毒易灭活.甲醛,乙醚,升汞,过氧化氢,高锰酸钾和季胺类化合物(如本扎溴铵)等化学药品对RV都有杀伤作用.1% 甲醛或3% 来苏尔15分钟可使病毒灭活.20%乙醚,10%氯仿,75%酒精,5% 碘酊和0.1% 胰蛋白酶等也可使病毒灭活.

六 RV的分类

1.血清学分型

WHO狂犬病专家委员会第8次会议(1992年)根据不同毒株的免疫血清反应和抗RV单克隆抗体的分析,将世界各地的RV分成四个血清型,另有一些病毒归为待定型.

血清学分型

血清I型:为CVS原型株,包括全球多数地区从陆栖哺乳动物,北美的食虫蝙蝠以及从拉丁美洲吸血蝙蝠中分离到的RV,还包括实验室的固定毒株.

血清Ⅱ型:Lagos—bat病毒原型株,从尼日利亚的蝙蝠中分离获得.

血清Ⅲ型:Mokola病毒原型株,在尼日利亚从地鼠内脏中分离得到.

血清Ⅳ型:Duvenhage病毒原型株,在南非从病人中分离得到.

II,III和Ⅳ型为狂犬病相关病毒.

过去曾把这些病毒列入虫媒病毒中,后来发现这些病毒的形态和血清学与RV有关,并在感染细胞内也形成包涵体,于是定名为狂犬病相关病毒,在病毒分类置于狂犬病毒属内.

2. 基因分型

根据RV的N基因和G基因的氨基酸相似程度重新研究该属内的分类,可区分出6种明显不同的基因型.前4种基因型分别与4种血清型相当,而另2种基因型的病毒原来属待定型,现分别划为基因5型和基因6型.在非洲从蚊中分离的Obodhiang病毒和Kotonkan病毒目前仍属未分类狂犬病毒.基因1型以外的所有RV又称"狂犬病相关病毒",目前仅在非洲,欧洲和美洲发现.近年来在澳洲和日本各发现了一种新的狂犬相关病毒,发现者将其分别暂命名为基因7型和基因8型,尚有待相关主管机构的确认.

基因分型

基因1型内较相似毒株(如PV株与SAD Bl9株)间N基因的氨基酸序列99.1%相同,差别较大的毒株(如疫苗株与美国食虫蝙蝠毒株)间的相应值为 97.6%.

而不同基因型的毒株间N基因氨基酸序列相似性最高为93.3%(如基因4型与5型),最低仅为79.8%(如基因3型与1型).不同毒株间G基因的差别较N基因的差别大.

G基因编码的膜外区的氨基酸序列在同一基因型内相似性可低至87%,在不同基因型之间相似性最高也仅为84%.

基因分型

如附图所示:

基因2型和3型在种系发生树上彼此关系密切,但它们与基因1型相距较远.

基因3型与1型在种系发生树中距离最远,对两者的基因组的相互比较说明它们之间的遗传差别最大.

基因4型和5型彼此密切相关,它们与基因1型在种系发生树中的距离较2型和3型略近.

基因6型与基因1型的关系最密切,遗传上的差别最少.

RV起源于非洲的假说

尽管在非洲有关狂犬病的明确记载出现较晚,但这并不能证明狂犬病(特别是野生动物中的狂犬病)在非洲出现较晚.特别是在70年代初在非洲发现了至少五种病毒在血清学上与RV相关,这些病毒只感染几种特殊的动物和昆虫(包括蚊子),偶尔也可感染人,而且目前使用的RV疫苗对这几种病毒无效.这些病毒的存在目前还只局限于非洲.因此有人提出RV起源于非洲(而不是亚洲),并和有关的几种病毒相伴发展的假说.

3. 血清(基因)1型RV

在世界范围的流行特点

迄今对血清1型RV野毒株遗传多样性的研究主要集中在N,G和伪基因.根据所得序列资料,结合不同毒株的地理分布,历史演变和与宿主类群的关系等,可勾画出该型病毒的辐射状种系发生树.

中国疫苗株和街毒株的比较

中国目前所用的RV疫苗株3aG和街毒株CGx89—1的G蛋白氨基酸的同源性仅为89.5%,已有较明显的差别.而两者与PV疫苗株相比,相应的同源性分别为91.2%和84.1%.这说明疫苗株间也有差别,在中国如用PV株作菌苗株,效果可能不如国内的毒株.

七 RV的变异

过去认为RV只有一个血清型,一般认为病毒遗传特性稳定,变异甚少. 近年来随着单克隆抗体和核酸序列分析等分子生物学技术的应用,发现RV的变异现象很普遍.

RV的变异归纳起来分两大类:

一是环境中自然发生的变异,二是实验室人工诱导的变异.

1. RV的自发变异

1) 致病性

在不同地区,不同生物种系里分离的RV的致病性不完全相同.我所多年来从我国各地及邻国越南共收集了来源于不同动物(包括人)的20余株RV街毒株,研究证明这些病毒的致病性有强有弱.颅内接种小鼠后出现的症状有早有晚,症状表现也不一样,主要有两种类型:

一种是麻痹型,以四肢瘫痪为主.另一种为痉挛型,以头颤动,四肢和躯体痉挛为主.

2) 抗原性

自然界的RV抗原性是不完全相同的.将所收集的我国各地区的RV街毒株的病毒滴度调至同一个水平,经甲醛灭活后再免疫小鼠,结果诱生的中和抗体效价不同,其诱生的抗体对其他病毒的中和活力不同,免疫小鼠的保护力也有区别.但它们之间都有一定的交叉中和和交叉保护作用.

3) 病毒基因组的核苷酸序列

自然界RV的变异必然反映在病毒基因组的核苷酸序列上.由上海市卫生防疫站从上海郊区疯狗中分离的狂犬病街毒SBD07的G基因序列,与广西分离的街毒CGX-89-1株的G基因的序列是有差异的:SBD 07和CGX—89—l与3aG相比,同源性分别为88.5%和84.5%,这两株街毒与CVS株比较,其同源性分别为87.2%和83.1%.若将G基因分段比较,差异更明显.两街毒株跨膜区与CVS相比,其同源性分别为54.5%和71.2%.膜内区与sC株相比,同源性分别为53.3%和72.7%.

两株狂犬病街毒G基因

序列同源性(%)分析:

SBD07/3aG CGX—89—1/3aG SBD07/CVS CGX—89—1/CV

全基因 88.5 84.5 87.2 83.1

膜外区 91.3 85.8 91.8 84

跨膜区 72.7 74.2 54.5 71.2

膜内区 53.3 72.7 62.2 77.3

法国流行的12个街毒株

G与L基因间序列的比较

法国巴斯德研究所直接用PCR产物测序方法测定了90年代初法国流行的12个街毒株

G与L基因间的序列.街毒株之间的差异为2%,与疫苗株的差异达14.7%.该区段的序列可能是多基因家族中的成员,因碱基顺序发生某些突变而失去功能,不能表达或表达异常,生成无生物活性的多肽,是进化上某个蛋白编码基因的残迹.它最易发生突变,代表着病毒的自然进化,适合于区分病毒的亲缘关系.

我国18株街毒 N基因

部分序列的测定和分析

最近由我所与美国CDC合作对我国18株狂犬街毒的N基因的第1094-1415位核苷酸(共322个核苷酸)进行了测定和分析.有3株病毒为同年同地分离,其中两株同源性为100%,另一株为99.38%.与其他株的同源性最低的为 81.66%.

按该18株病毒的核苷酸差异的程度可分成3组,第一组多属于我国东部地区,第二组主要分布我国西部地区,第三组为南部地区,并构制成我国狂犬街毒系统发生树.

结果说明我国RV街毒株的N基因核苷酸序列差异与地区分布有关.

2. RV的人工变异

研究RV的实验室人工变异主要目的是为了防治狂犬病,研制疫苗,首先是由街毒变为固定毒.以后为了降低狂犬病疫苗的副作用,采用组织培养细胞制备疫苗,使病毒适应于细胞上增生以及降低毒力等研究.病毒在不同的实验室环境下传代发生的变异,必然会反映在病毒基因组的结构和序列上,并伴有一些生物学特性的变化.

1) 街毒变为固定毒

RV的人工变异始见于1881年,巴斯德将自然界疯牛脑中分离到的狂犬病街毒株(street vires),经家兔脑内连续传9代,发现其潜伏期由15-20天缩短为6-7天,并伴有其他一些性状的改变,为此开创了RV中存在"街毒"和"固定毒"两类性质不同的病毒的新概念.

人们把直接从自然界中分离到的RV称为街毒,街毒在实验室中传代,其特性发生改变(见下表)称其为固定毒.

1885年巴斯德第一次在一个被狂犬咬伤的孩子身上,将他研究的固定毒经干燥减毒后制成疫苗进行接种,成功地挽救了该孩子的生命,开创了狂犬病疫苗的新纪元,也为其他病毒性疾病的预防奠定了基础.由街毒变为固定毒的速度不尽相同,有的经过几次传代即可,,有的却需要50多代.一般情况下,毒力越强,越易固定.

街毒与固定毒特性的比较

形状街毒固定毒

脑内注射潜伏期 15-20天 4—7天

对外周注射的致病性高低

包涵体形成常见罕见

脑白质与灰质内含病毒的比例 1:2 100-200

动物症状狂躁型为主麻痹型为主

对人致病性强弱

2) 在组织培养细胞中的增殖能力

RV有严格的嗜神经性,在一般非神经的组织培养细胞上复制能力极低,用常规的传代方法,往往随着连续传代次数的增加而病毒滴毒逐渐下降,甚至消失.RV适应在人二倍体细胞或原代地鼠肾细胞上,都是通过用感染病毒的细胞和未感染病毒的细胞混合在一起传代,并逐渐加大未感染细胞的比例.随着病毒的传代,对非神经细胞中的增殖能力不断提高,达到可用于生产疫苗的水平.

我国疫苗用毒种的来源

20世纪60年代,以我所为首的几个生物制品所用此方法得到了生产疫苗用的毒种aG株:将我国分离的RV北京株在 PHKC上培养20天左右,以被感染的细胞和未感染的细胞混合传代,逐渐加大未感染细胞的比例,在单层的PHKC上持续传50代,病毒在PHKC中的增殖滴度升高约为4.5 lg LD50/ 0.03ml以上,再通过豚鼠脑与PHKC交替传代,反复交替3次为"3aG'',交替5次的称"5aG".3aG或5aG的豚鼠脑悬液为生产毒种,滴度大于或等于7.0 lg LD50/0.03ml.

北京检定所等用CTN株或aG株适应于非洲绿猴肾传代细胞(Vero)中,可作为生产精制RV Vero细胞纯化疫苗的毒种.我所已完成这种新一代疫苗的四期临床考核.

3) 毒力(减毒活疫苗株的来源)

早在1940年, Koprowski从狂犬病致死的女孩脑内分离的病毒,以死者名命名为 "Flury'' 株,在一日龄雏鸡脑内传138代成为固定毒,以后又在鸡胚中传178代,其致病性进一步减弱,以鸡胚传代次数区分,将68代前称为 "LEP'' (鸡胚低代株),136代后称为 "HEP" (鸡胚高代株).

据Sharpless报道,以 HEP制备的活疫苗接种了149人,证明对人无致病性,毒力变弱.

毒力(减毒活疫苗株的来源)

以后用以细胞为主的传代方法获得了减毒株SAD,ERA,SADBern,SADBl9及Vnuko- vo32,曾用这些病毒试制过兽用活疫苗,这些病毒经野生动物口服已无毒性,但成鼠脑内途径接种仍有致病性.

80年代以后,从CVS,ERA,SADBern等病毒中筛选出糖蛋白333位氨基酸和330位氨基酸的突变株,并伴有毒力下降或成为无毒株.

最近Coulon等又报道用RV抗糖蛋白第III抗原区的单克隆抗体筛选出10株抗原变异株中有9株表现出毒力减弱或无致病性,这些毒力变异株均有糖蛋白333位氨基酸和330,338等位上氨基酸发生了置换.

4) 生物学特性

病毒在细胞中连续传代除了发生对细胞适应性的改变,提高病毒增殖滴度及降低病毒的致病性外,还经常伴有其他一些生物学特性的改变:如原来感染细胞后不出现细胞病变的变为出现细胞病变;原来感染细胞后出现大空斑的,经传代后空斑由大变小;有时还会在培养液中出现缺陷干扰病毒颗粒,特别是在培养液中 pH偏低的情况下,病毒表面的糖蛋白发生改变,甚至产生表面无突起的病毒等.

5) 病毒基因组结构和序列

在实验室里,不同传代经历的固定毒其序列是不同的,如减毒株SADBl9与PV株相比,其G基因和 C—L间区的长度发生了变异,而且这类似的变异在减毒株HEP—Flury中也存在.另外各株的糖基化位点亦有差别和变异.对不同毒株的5个结构基因序列比较,大量资料证明G和M基因变异幅度较大,而 N基因相对稳定.中国RV 3aG和5aG株不同代的病毒核苷酸序列也不完全相同,这两个aG株与 CVS和PV株的同源性也有区别.

八 RV用作基因重组载体及其应用前景

RV是死亡率百分之百的狂犬病的病原体,如何变害为利,将这种可怕的病毒变成基因重组程载体用作对付其他疾病的有力工具,这是对人类想象力和智力的一次挑战.近年来,德国的 Mebatsion 等率先完成以RV为基础的基因工程载体的构建,并与美国的科研人员合作,成功地以此载体制备了包括HIV-1 重组疫苗在内的多种重组活疫苗.

这是病毒分子生物学和疫苗学领域的一项重大进展.

RV重组载体的优点:

1. 其基因组结构简单,较其它大多数DNA或正链RNA病毒基因组容易加工和操作处理.

2._其核衣壳具螺旋结构,其载体能容纳较大的外源基因.

3._弹状病毒在细胞质复制,不会对细胞核的分裂产生有害的影响.

4. 人群中仅存在极少数RV血清抗体阳性的个体,故不会干扰针对目的蛋白的免疫.

5. 其载体的N蛋白是超抗原,能诱生B细胞反应,同时还能诱生强的CTL反应.

RV重组载体的优点:

6.其重组病毒疫苗可诱导粘液免疫反应.

7.其不分节段基因组在细胞中连续传代很多次后外源基因非常稳定.

8. 在多种细胞系中可生长到109 FFU(荧光灶形成单位)/ml的高滴度而不杀伤细胞,这样可以比其它能引起细胞病变的载体更长时间地表达外源基因.

9. 在弹状病毒系统中,外源基因的表达水平有可能通过选择插入位点来调整,所以该载体在恰当地表达各种病原体的多种基因和抗原方面很有发展前途.

10. 利用弹状病毒对特殊细胞(如中枢神经细胞)的趋向性,有可能将基因定向引入特定的靶细胞.

RV用作基因重组载体的应用前景

用RV构建的基因工程载体在未来的疫苗学和基因治疗研究中可望获得广泛的应用,并可能为这些领域中当前面临的若干重大疑难问题提供全新的解决方案.

九总结与展望

RV的历史悠久,而且宿主范围和地理分布范围都很广泛.但序列分析资料表明,与其他许多RNA病毒相比,RV的进化速率较缓慢,因此当前使用的狂犬疫苗(基因l型)总的来讲仍能有效对抗属于基因1型的街毒株.不过即使是在基因1型内,疫苗株与某些街毒株的基因序列及相应的抗原性仍存在较大差别,而且现用疫苗株并非处在基因 1型种系发生树的中心,所以狂犬疫苗免疫失败的情况也时有发生.今后很有必要在对RV作更广泛的分子流行病学研究的基础上,选择与多数街毒株抗原性差别最小的毒株用作疫苗株以提高疫苗的效力.

总结与展望

关于狂犬病相关病毒:

就现有资料,RV基因2—6型,即狂犬病相关病毒,仅在非洲,欧洲和美洲发现,感染人的病例十分罕见.但几乎每种基因型都曾致人死命.

交叉保护研究确定,当前的狂犬疫苗(基因1型)对抗原差异最大的基因3型(Mokola病毒)毫无保护作用,对基因2型和4型的保护不完全,对基因 5型的保护依赖于所用的疫苗株(有的疫苗株无效).尽管目前狂犬相关病毒尚未对人类健康造成很大威胁,为了做到有备无患,Tordo等已研制出用昆虫杆状病毒表达的Mokola病毒 G蛋白疫苗,并已在动物实验中证明有效.