RNA提取方法(TRIzol法)
一、试剂准备
1、 TROzlo试剂、氯仿、75%乙醇(0.1% DEPC配制)。
2、 塑料器皿需用0.1% DEPC水浸泡。
3、 0.1%DEPC水:100ml dd水中加入DEPC0.1ml,充分振荡,37℃孵育12h以上,121℃高压灭菌20min,于4℃保存。
二、操作步骤
1、样品处理
(1) 组织:50-100mg组织中加入1ml TROzlo试剂。
(2) 单层细胞:加入TROzlo试剂1ml/cm2平板。
(3) 悬浮细胞:处理前洗涤细胞,以防止RNA降解。每5-10×105动物、植物或酵母细胞,或1×107细菌加入1 ml TROzlo试剂。
2、将上述样品于15-30℃静置5min,使核蛋白充分解离。
3、加入0.2ml(1 ml TROzlo试剂)氯仿,盖紧盖子,充分剧烈振荡15s并于15-30℃静置2-3min。
4、于2-8℃ 12000g离心15min。离心后样品分层,上层水相中含RNA,下层有机相中含蛋白和DNA。
5、取上清,加入0.5ml异丙醇,轻轻混匀,于15-30℃静置10min后,在管底会出现胶状沉淀,即为RNA。
6、于2-8℃ 12000g离心10min后弃去上清。
7、向沉淀中加入1ml 75%乙醇,轻轻混匀。
8、于2-8℃ 7500g离心5min后弃上清
9、 将RNA样品凉干(不要彻底干燥),加入适量DEPC水溶解(可于55-60℃促溶10min)。
三、注意问题
1、在加入氯仿之前(第1步),样品能于-60—-70℃保存至少一个月。
2、RNA沉淀(第6步)在75%乙醇中于2-8℃能保存至少一周,于-5—-20℃能保存至少一年。
四、RNA定量
RNA(mg/mL)=40×OD260×稀释倍数(n)/1000
RNA纯品OD260/OD280=2.0
五、RNA电泳
(1)用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶,加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。
(2)在超净工作台上,用移液器吸取总RNA样品4µl于封口膜上。在实验台上再加入5µl 1×TAE电泳缓冲液及1µl 的10×载样缓冲液,混匀后,小心加入点样孔。
(3)打开电源开关,调节电压至100V,使RNA由负极向正极电泳,约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果
本文来源:https://www.2haoxitong.net/k/doc/3dee7c75a12d7375a417866fb84ae45c3a35c242.html
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