一 材料、试剂和仪器1 材料 新鲜的组织材料或-80℃冻存的材料2 试剂(1)2×CTAB溶液(2)氯仿/异戊醇(24:1)(3)RNaseA 10mg/ml(4)乙醇或异丙醇(5)β-巯基乙醇(6)氯仿/异戊醇(25/24/1)(7)70%乙醇3. 仪器: 离心机, 恒温水浴, 台式高速离心机,电泳装置二、实验程序1.在2mL离心管中,加入500μl的2×CTAB和20 μlβ-巯基乙醇, 65℃预热。2嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净,再用灭菌ddH2O冲洗2次,放入经液氮预冷的研钵中,加入液氮研磨至粉末状,用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中,总体积达到1mL混匀后置65℃水浴中保温45-60min,并不时轻轻转动试管。注:冻存材料直接研磨,绝对不能化冻。而且粉末应在化冻前转移否则内源性Dnase有可能降解基因组DNA。3加等体积的氯仿/异戊醇,轻轻地颠倒混匀,室温下10 000rpm离心10 min,移上清至另一新管中。4向管中加入1/100体积的RNase A溶液,置37℃20-30min。5加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇,会出现絮状沉淀,-20℃放置30 min或-80℃放置10min,12 000rpm离心10-15min回收DNA沉淀。6 用70%乙醇清洗沉淀两次,吹干后溶于适量的灭菌ddH2O中。7 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。
原理:
这种方法是由Murray 和Thompson(1980)修改而成的简便方法。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中((0.7 mol/L NaCl)是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白,多糖类物质分开。
最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA,而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
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