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03不同培养基对成年大鼠心肌细胞形态_存活率_收缩功能的影响

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中国微循环2009年2月第13卷第1期　文章编号:100728568(20090120055205
・55・
・技术与方法・
不同培养基对成年大鼠心肌细胞形态、存活率、收缩功能的影响
宫海滨,王　洁,王　雷
【摘要】　目的　研究不同培养基对成年大鼠心肌细胞形态、存活率和收缩功能的影响。方法　本实验采用Langendorff装置行恒流灌流分离成年大鼠心肌细胞,分别用无血清M199、DMEM高糖、DMEM低糖三种培养基培养,比较培养24h和48h的细胞存活率(即杆状率、形态和单个细胞收缩功能的变化。结果　培养24h后,M199培养基中细胞存活率校正值(培养细胞杆状率/刚培养细胞杆状率明显高于其他两种培养基(P<0.05,细胞平均长度(Length、细胞缩短率(细胞收缩幅度/细胞原始长度、达到峰值收缩时间(TTP、50%舒张时间(R50、90%舒张时间(R90亦最接近新鲜分离心肌细胞;培养48h后,M199培养基中细胞Length、TTP、R50、R90各指标均明显优于其他两种培养基(P<
0.05。结论　三种培养基培养成年大鼠心肌细胞M199对维持细胞的存活状态、形态和功能的效果
最好。
【关键词】　心肌细胞;细胞培养;存活率;收缩功能;大鼠中图分类号:Q831.1+1　　　　文献标识码:B
InfluenceofVariousCultureMediaouMorphology,SurvivalRateandContractileFunctionofA2dultRatCardiomyocytes
GONGHai-bin,WANGJie,WANGLei.TheCardiovascularDiseaseInstituteofXuzhou,XuzhouCentralHospital,Xuzhou221009,China
【Abstract】　Objective　Toinvestigatedifferentculturalmediaonmorphology,survivalrateandcon2
tractilefunctionofadultratmyocardialcells.Methods　TheheartwasmountedonaLangendorffperfusionapparatuswithconstantflow,myocardialcellswereculturedrespectivelyinserum-freeM199,DMEMHGandDMEMLGmedia.Survivalrates(thatisrodshaperateof24hand48hwerecalculated,thechangesofmorphologyandcontractilefunctionofasinglecellwereobservedsimultaneously.Results　whenculturedfor24h,correctionvalueofsurvivalrateinM199wasobviouslyhigherthanthatoftheothertwomedia(P<0.05,theaveragecelllength,cellshortening(rangeofcontraction/celllengthofinitial,TTP(contractiletimetopeak,R50(50%relaxationtimeandR90(90%relaxationtimewereclosesttothosefreshlyisolated;whenculturedfor48h,cellsinM199hadthebestLength,TTP,R50andR90comparedwiththeothertwomedia(P<0.05.Conclusion　Threemediaformyocardialcellsinvitro,cellsinM199hadhighersurvivalrate,bettermorphology,morestablecontractilefunctioncomparedwiththeothertwomedia.
【Keywords】　Cardiomyocytes;Cellcultivation;Survivalrate;Contractilefunction;Rat
　　成年心肌细胞的功能特性是其他发育阶段心肌细胞不可替代的。单个心肌细胞已成为研究心脏结构、代谢、功能、病理生理及其机制的重要工
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30572073,江苏省自然科学基金资助项目(BK2005428,江苏省“六大人才高峰”第三
((批资助项目C类,江苏省医学重点人才RC2007024。
作者单位:221009　江苏省徐州市心血管病研究所,徐州市中心医院
第一作者简介:宫海滨(1965-,男,博士,教授。主要研究方向:心力衰竭的基础及临床研究。
具。近年来,随着心肌细胞电生理和分子生物学研究及心肌中功能相关基因研究的兴起,使得成年心肌细胞被越来越多地应用于心血管病理生理的研究。体外培养心肌细胞有很多优点:对急性分离造成的持续损伤有一定的修复作用,包括被损伤的表面蛋白如受体、离子通道的重新表达等;可以进行长期的研究与观察,把急性分离的心肌细胞置于体外培养基中;可避免体液和其他刺激因素对心肌细

・56・
JChinMicrocircFeb.2009,Vol.13,No.1
胞功能的影响;心肌细胞相关基因转导亦需要体外培养的细胞。因此,本文试图探索一种比较好的成年心肌细胞培养方法以供临床研究。
材料与方法
1　实验动物及材料
5min,最后用酶液灌流10min左右,整个灌流过程中
温度保持37℃。剪下心脏,剔除左右心房,把心室部分剪成约1mm×1mm的组织块,于酶液中在35℃下轻轻地震荡孵育3～5min,并通以100%O2,将有单个细
胞散落下来,用300μm的尼龙网过滤细胞,将剩余的组织块再加新鲜酶液继续震荡孵育3～5min后过滤,将两次的滤液合并,室温下400r/min离心1min,弃上清,细胞用1mmol含钙KH液洗三遍,放置10min,待自然沉降后换液。
3.2　心肌细胞培养　在24孔板中,用含10%
雄性SD大鼠10只,体质量200～250g,由徐州医学院实验动物中心提供。胶原酶Ⅱ为worthing2ton公司产品;DMEM高糖培养液、DMEM低糖培养
液为GIBCO公司产品,牛血清白蛋白(BSA购自sunshine公司;特级胎牛血清为Hyclone公司产品;M199培养基、丙酮酸钠(Sodiumpyruvate、氨基三
胎牛血清的M199、DMEM高糖、DMEM低糖培养液依活细胞数2×10/孔的细胞量培养细胞
4
[2]
,每孔
乙酸(NTA、维生素C(AscorbicAcid、肌酸(Crea2
tine、牛磺酸(Taurine、肉毒碱(Carnitine、双抗(Penicillin-Streptomycin、胰岛素(Insuline等试
加入1ml细胞悬液。在培养箱内培养2h使细胞黏附于培养板壁上,轻轻吸去含血清培养基,用无血清培养液反复洗涤三遍,最后用无血清培养液培养至48h,计算换液后、培养24、48h细胞杆状率并观察细胞的形态。
3.3　心肌细胞的形态的判断　在倒置显微镜
剂均购自sigma公司。
2　液体配制
①1mmol/L含钙KH液(mmol/L:NaCl119,KCl4.7,MgSO4・7H2O0.94,KH2PO41.2,NaHCO325,Glu2cose・H2O11.5,CaCl21,通5%CO2+95%O2混合气
下观察:静止的、折光性强、膜表面光滑且横纹清晰、两端边缘锐利的细胞可认为是良好的心肌细胞。具有下列特征之一即可判定为较差的心肌细胞:不停地扭动、折光性差、膜表面呈泡状且横纹模糊或两端圆钝。
3.4　计数　①细胞密度的计算:经测量新鲜
体,pH为7.4。②无钙液(mmol/L:NaCl120,KCl5.4,MgSO4・7H2O5,Sodiumpyruvate5,Glucose・H2O20,Taurine20,HEPES10。③临分离前在无钙液
中加入5mmolNTA和12μmol～14μmolCaCl2即为低钙液,调pH6.95,充100%O2。④酶液,在无钙液的基础上加入1mg/ml胶原酶II和50μmolCaCl2,溶解后,调pH7.4,充100%O2。⑤M199培养液,M199培养基中加入以下添加剂(mmol/L:AscorbicAcid100、Crea2tine5、Taurine5、Carnitine2、Insuline0.0001和0.2%BSA。常规加入100UPenicillin-100mgStreptomycin、2.2gNaHCO3、25mmolHepes。调pH7.2,过滤除菌。
分离心肌细胞平均长度大于0.1mm,而计数板和盖玻片之间的距离是0.1mm,故不适合采用血球计数
[3]
板计数。我们采用视野计数法,视野直径(mm=目镜视场数/物镜倍数,可计算出每个视野的面
积(Svf,培养板孔面积为S,把1ml细胞悬液加入到24孔板的一个孔中,随机取5个视野,计数5个视野中杆状细胞总数,活细胞密度(个/ml=(5个视野中杆状细胞总数/5×S/Svf。Corning公司24孔培养板孔面积为1.9cm,每孔加入1ml细胞悬液,OlympusIX71倒置显微镜(目镜视场数2220倍物镜下计数,活细胞密度(个/ml=(5个视野中杆状细胞总数/5×200,调整活细胞密度至2×10/ml进行培养。②存活率的计算:换液后三种培
4
2
⑥DMEM高糖培养液:每升中常规加3.7gNaHCO3,100UPenicillin-100mgStreptomycin,25mmolHepes。
调pH7.2,过滤除菌。⑦DMEM低糖培养液每升中常规加入3.7gNaHCO3,100UPenicillin-100mgStrepto2mycin,25mmolHepes。调pH7.2,过滤除菌。
3　实验方法
3.1　心肌细胞的分离　取SD大鼠,于取心脏前30min腹腔注射肝素钠(1500U/kg,再腹腔注射戊巴
[1][2]
比妥钠(50mg/kg。参照文献的方法进行分离,
养液均随机取五个视野,10×物镜下拍照,并用记号笔作上标记,24、48h均用标记处的视野拍照,分别计算三种培养液中细胞在换液后、培养24、48h的杆状率。存活细胞百分比(%=(长杆状细胞数量/全部细胞数量×100%
[4]
迅速开胸,取心脏于冰冷1mmol含钙KH液中停跳,并挂于Langendorff恒流灌流装置上,用1mmol含钙的KH液经主动脉逆行灌流5min,再转换成低钙液灌流
,存活率校正值(%
=24h或48h杆状率/换液后杆状率×100%。

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3.5　单个心肌细胞收缩功能的测定　刚分离
和培养的细胞均用KH液洗3遍,滴2滴细胞悬液于收缩功能测定的浴槽内,静置5min后,用预先充5%CO2混合氧的2mmol含钙KH液灌流并电刺激心肌细胞,实验在37℃下进行,液体流速1.5ml/min,刺激阈值为0.5Hz,10min后,选取收缩稳定的细胞,通过动态影像边缘探测系统(IonOptix,US记录心肌细胞收缩曲线,统计细胞缩短率(%、达到峰值收缩时间(TTP、50%和90%舒张时间(R50,R90。
4　统计学处理及方法应用SPSS13.0统计软件包进行数据统计学处理。组间比较,方差齐性则进行方差分析,方差不齐则进行非参数秩和检验。结果以均数±标准差(-x±s表示,并计算P值,以P<0.05为具有统计学意义。
结　果
1　三种培养液培养成年大鼠心肌细胞形态学
图1　即刻换液后心肌细胞
DMEM低糖培养液中细胞存活率培养48h后,三种培
养液中细胞存活率校正值之间无明显差异(表1。
3　三种培养液培养成年大鼠心肌细胞收缩功
能比较
新鲜分离的心肌细胞平均长度(110.3±11.2μm(表2;培养24h后,三种培养基中的细胞末端都比新鲜分离的轻微变圆,但M199培养液中心肌细胞平均长度明显长于DMEM高糖中的细胞长度(P<0.05,亦长于DMEM低糖中的细胞长度(表3;培养48h,M199培养液中细胞的长度明显长于DMEM高糖(P<0.01和DMEM低糖(P<0.01中细胞的长度(表4,且边缘整齐,扭曲变形的程度小。
培养24h后,三种培养液中单个心肌细胞收缩功能均比即刻分离时减弱,表现为细胞缩短率下降,达到峰值收缩时间(TTP、50%舒张时间(R50、90%舒张时间(R90均有延缓。其中M199培养液中心肌细胞缩短率明显高于DMEM高糖(P<0.01和DMEM低糖(P<0.05中细胞缩短率(表3;培养48h后,M199培养液中心肌细胞缩短
比较
刚分离心肌细胞杆状率大于70%,分离一个大
6
鼠心脏心肌细胞获得率可达2×10个。1mmol/L含钙KH液中静置10min后,不停扭动的细胞很少见,小于5%的细胞会有自发性收缩,细胞膜表面光滑,横纹清晰,两端边缘锐利,折光性较强,但也有少量心肌细胞出现末端膨大或细胞膜表面呈现密集小泡。这些结果表明,采用此分离方法可获得高产量与高质量的成年大鼠心肌细胞,且易于操作,重复性较好,为细胞培养观察奠定了基础。培养2h换液后,由于死细胞与质量差的细胞被吸走,心肌细胞杆状率可达90%～95%(图1。
2　三种培养液培养成年大鼠心肌细胞存活率比较
大鼠心肌细胞即刻换液存活率可达70%,培养24h后,M199培养液中细胞存活率明显高于DMEM高糖培养液中细胞存活率校正值(P<0.01,亦高于
率明显高于DMEM高糖(P<0.01,亦高于DMEM低糖,TTP和R50也明显小于DMEM高糖和DMEM低糖培养液(P<0.05,最接近即刻分离时的功能状态(表2、4。
表1　三组培养液培养心肌细胞存活率结果对比分析(-x±s,n=10
组别
M199组DMEM高糖DMEM低糖
细胞培养次数
101010
即刻换液
0.79±0.10△0.67±0.0730.72±0.11
24h存活率
△
0.65±0.14△
24h存活率校正值0.82±0.10△△0.67±0.12330.72±0.11
48h存活率0.37±0.140.29±0.160.34±0.15
48h存活率校正值
0.46±0.150.43±0.220.46±0.17
0.45±0.11330.52±0.133
△
　　　注:与M199组比较,3P<0.05,33P<0.01;与DMEM高糖比较,△P<0.05,△P<0.01。

・58・
表2　即刻分离相关参数(-x±s
组别
KH液
JChinMicrocircFeb.2009,Vol.13,No.1
细胞培养次数
30
Length(μm110.3±11.2
Shortening(%8.16±1.49
TTP(s0.096±0.010
R50(s0.036±0.006
R90(s0.104±0.025
表3　培养24h三组相关参数对比分析(-x±s
组别
M199组DMEM高糖DMEM低糖
细胞培养次数
303030
Length(μm101.2±12.892.8±14.0394.4±14.6
Shortening(%8.12±1.666.59±1.44337.58±1.56△
TTP(s0.123±0.0170.130±0.0170.126±0.017
R50(s0.051±0.0100.057±0.0150.056±0.010
R90(s0.108±0.0240.129±0.0310.120±0.024
△
　　　注:与M199组比较,3P<0.05,33P<0.01;与DMEM高糖组比较,△P<0.05,△P<0.01。
表4　培养48h三组相关参数对比分析(-x±s
组别
M199组DMEM高糖DMEM低糖
细胞培养次数
303030
Length(μm
△
94.7±14.5△
Shortening(%
△
8.02±2.07△
TTP(s0.120±0.0190.121±0.0210.133±0.0273
R50(s0.053±0.011△0.060±0.01430.061±0.0113
R90(s0.133±0.030△0.152±0.03830.140±0.024
83.1±13.43384.8±15.933
6.51±2.54337.50±1.85
△
　　　注:与M199组比较,3P<0.05,33P<0.01;与DMEM高糖组比较,△P<0.05,△P<0.01。
讨　论
培养心肌细胞主要有两种基本方法
[5]
,一种是
吹散成悬浮状态。我们的体会是细胞附壁能力与分
离的心肌细胞的质量和培养的密度有关,刚分离下来的呈长杆状,无明显搏动,表面光滑,横纹清晰的细胞很容易附壁,所以分离不同的心脏细胞附壁能力差别很大,如果一个心脏分离下来的细胞状态比较差,就要重新再分离一个心脏,培养的密度亦非常重要,如果密度过大,细胞成簇地堆在一起,使得细胞附壁能力减弱,换液时将有大量的细胞被吸走。心肌细胞对剪切力和培养基湍流的冲击也很敏感,因此操作要轻柔。
我们在总结国内外实验室培养成年心肌细胞方法的基础上,如Lewis等大鼠心肌细胞,Rust等
[6]
用含血清培养基培养,通常不使用黏附因子,细胞处于悬浮状态很容易变圆,2～4d贴于培养器皿表面并伸出伪足样结构,细胞超微结构的改变提示细胞出现了分化;另一种方法是用无血清培养基培养,用黏附因子预处理培养器皿表面,培养3h后使心肌细胞贴壁,这种方法可以保持心肌细胞的长杆状结构1周左右,常用的黏附因子有层黏连蛋白(Laminin、Ⅳ型胶原、稀释的胎牛血清。
在做心肌细胞收缩功能试验时,需要维持细胞的形态,因此采用无血清培养基培养。加黏附因子培养虽然可以很好的维持细胞的形态,但因细胞与培养器皿底面牢固地黏附在一起,无法把细胞吹散成为悬浮状态,即使在培养时加入用黏附因子预处理的盖玻片,做收缩功能试验的时候连同盖玻片一起移入灌流槽内,细胞在接受一定频率电刺激的时候,由于细胞牢固地黏附在盖玻片上,仍不能正常收缩,因此我们采用含10%胎牛血清的培养基按2×10/cm的密度在24孔培养板中培养2h使细胞黏附于培养板壁上,用无血清培养基小心换液,反复洗三遍,由于死细胞和质量差的细胞贴壁不牢换液时被吸走,因此可以获得高存活率高质量的心肌细胞用于培养,轻轻移动培养器皿,心肌细胞不会移位,取细胞时也很容易被
4
2
用M199培养基培养成年
[7]
采用DMEM培养基培养成
年大鼠心肌细胞,我们采用M199培养基、DMEM高糖、DMEM低糖三种常用的培养基按上述方法培养
成年大鼠心肌细胞并对培养结果进行分析。从存活率方面比较,换液后三种培养液中细胞存活率并不完全相同,所以我们在培养24h和48h的时候选择用存活率校正值来反映培养基维持细胞存活状态的能力,培养24h,M199培养液中细胞存活率校正值明显高于DMEM高糖和DMEM低糖,但培养48h三种培养基中存活率校正值没有明显的差别,我们分析可能是在短期内(24hM199培养液中的某些成分能够延缓细胞的死亡过程,随着培养液中细胞代谢物及死细胞释放的有害物质的增多,48h时细胞因培养环境的

中国微循环2009年2月第13卷第1期　・59・
murinemyocytes:roleofNa+/Ca2+exchange[J].AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2006,291:H2199～H2209
2　JuliaGorelik,LinQYang,YanjunZhang,etal.AnovelZ-groove
indexcharacterizingmyocardialsurfacestructure[J].CardiovascularResearch,2006,72:422～429
3　O’ConnellTD,RodrigoMC,SimpsonPC.Isolationandcultureof
adultmousecardiacmyocytes[M].MethodsMolBiol.2007,357:271～296
4　张然,余志斌,王云英.成年小鼠心肌细胞分离技术[J].生理学
改变而大量快速的死亡,如果在培养24h时换液去
除有害物质的影响,48h时M199培养液维持细胞存活状态的优势应该会更明显。从形态方面比较,细胞长度和细胞边缘与新鲜分离细胞的差异程度可以反映培养基维持细胞形态的能力,培养24h时M199培养基中细胞的长度明显长于其它两种培养基,细胞边缘三种培养基中差异不明显,培养48h时M199培养基中细胞比培养24h时长度缩短程度要比其他两种培养基小,细胞边缘也比其他两种培养基整齐。从收缩功能方面分析,培养24h和48h细胞缩短率、TTP(s、R50(s、R90(s各指标M199培养液中的最接近刚分离心肌细胞。本工作与以往心肌细胞培养方法相比主要改进之处是用含血清培养基培养2h后换液,既提高了培养细胞的存活率,又避免了使用Laminin等黏附因子使细胞贴壁过牢而难于取细胞。
综合以上三个方面,我们认为三种方法培养成年大鼠心肌细胞,M199培养液加添加剂的方法可以获得更好形态和功能的心肌细胞。
参　考　文　献
1　AmyLTucker,JianliangSong,Xue-QianZhang,etal.Altered
contractilityand[Ca2+]ihomeostasisinphospholemman-deficient
报,2004,56:656～660
5　JohnSMitcheson,JulesCHancox,AllanJLevi.Culturedadultcar2
diacmyocytes:Futureapplications,culturemethods,morphologicalandelectrophysiologicalproperties[J].1998,39:280～300
6　CliveJLewis,HaibinGong,MorrisJBrown,etal.Overexpressionof
b1-adrenoceptorsinadultratventricular.myocytesenhancesCGP12177Acardiostimulation:implicationsfor‘putative’b4-adreno2ceptorpharmacology[J].BritishJournalofPharmacology,2004,141:813～824
7　ElizabethMRust,MargaretVWestfall,JosephMMetzger.Stability
ofthecontractileassemblyandCa2+-activatedtensioninadenovirusinfectedadultcardiacmyocytes[J].MolecularandCellularBiochem2istry,1998,181:143～155
(收稿:2008-05-05　　修回:2008-09-01
CardiovascularResearch,
(上接第54页
(2无氧代谢增加,乳酸产生增多,乳酸抑制肾小管
浓度,适当通过饮食药物等治疗降低血UA水平,对提高治疗效果,改善预后极为有利。而BNP浓度的
检测,可以帮助临床医师对HF的高危人群进行心功能检测、快速诊断、判断病情、指导治疗、评价疗效、以及评估预后。
参　考　文　献
1　赵丽,吴学思,韩智红,等.B型利尿肽检测对心力衰竭患者的临
分泌尿酸,尿酸排出减少,使血尿酸水平增高。(3
心排出量显著减少,肾脏灌注不足,肾小球滤过率下降,尿酸的排泄减少,亦导致血尿酸水平增高。(4胃肠道瘀血,由此排出的量亦可能减少,进一步提升了血UA的水平。(5交感神经兴奋,儿茶酚胺类神经递质及肾血流动力学改变等因素也可影响尿酸水平。本研究表明HF患者高尿酸血症发生率为39.2%。心衰越严重,高尿酸血症发生率越高,且升高的程度越大。血UA水平与心功能级别明显相关,可反映HF患者的病情程度。
[2]
Groote等阐述了BNP和UA是β受体阻滞剂应用时代HF的两个最强的预后因子。因此在对HF患者进行抗心衰治疗的同时,常规监测血尿酸
床评估[J].中华心血管病杂志,2004,32(1:51～52
2　GrootePD,MouquetF,LamblinN,etal.Serumuricacidisapower2
fulpredictorofsurvivalinpatientswithstablechronicheartfailurere2ceivingbeta-blockertherapy[J].Circulation,2007,116:Ⅱ650
(收稿:2008-06-23　　修回:2008-08-19

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/30b42b6f27d3240c8447efc9.html

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