平菇黑色素提取纯化鉴定及功能试验

子实体黑色素提取

研究平菇中对形成色泽的物质提取纯化，及功能研究。目前国内外对平菇中的黑色素类物质并没有做相关研究。

广义的黑色素包括两大类，一类是Tyr，多酚及他们相关化合物代谢的终产物黑色素melanin，这类黑色素是复杂黑色高聚物，又可分为三类：真黑素（eumelanin）、棕黑素（phaeomelanin）和异黑素（allomelanin）。真黑素含氮原子，不含硫原子，颜色为深棕色或黑色；棕黑素含氮原子和硫原子，颜色略带红色的棕色和黄色；异黑素呈棕色或黄色，主要存在于植物中。

另外一大类属于花色苷类黑色素，主要分布于植物中。

关于真黑素的生物合成，目前认为酪氨酸酶（TYR)是它们形成的关键酶，酪氨酸在酪氨酸酶连续催化作用下氧化成多巴，再氧化成多巴醌，后者经环化进一步氧化成某些中间产物。中间产物经重排和脱梭生成5,6一二轻基吲哚，后者再氧化生成相应的酮。吲哚-5,6-醌是形成真黑色素的主要前体，它与上述一些中间产物聚合生成真黑色素，但真黑色素的结构尚不完全清楚。

棕黑色素的形成过程，由酪氨酸到多巴醌与真黑色素是一致的。但在多巴醌以后的反应中有半胱氨酸(cysteine)参加，产生5-Cys一多巴和5-Cys-多巴醌，后者经环化、脱梭成为苯并嚎嗦的衍生物，这种衍生物经过聚合生成分子量更大的棕黑色素。棕黑素的形成过程，见图1.3:

可见，真黑素与棕黑素的主要区别就是在其合成过程中是否有半胱氨酸的参与，并且半胱氨酸是唯一的参与棕黑色素合成的硫化物。半胱氨酸与多巴醌的加成速度远远大于多

巴醌分子内的环化速度，当半胱氨酸存在时，即使量非常小，反应也倾向于合成棕黑素。

异黑素是在多酚氧化酶(polyphenol oxidase)存在下通过多酚氧化聚合而成的。

第二类花色苷类黑色素是花色素与糖以糖昔键结合而成的一类化合物。现已查明，天然花色昔配基的基本结构为3, 5, 7一三轻基-2一苯基苯并吠喃，结构式为图1.4:

在花色素A环3,5,7位上的羟基以糖苷键与糖结合时便形成花色苷，由于糖结合的方式不同，如结合糖的种类、数量、位置的不同，花色苷的种类也不相同。

1.4天然黑色素的萃取方法

天然黑色素的萃取应根据不同原料所含色素性质的不同来选择，一般要求溶剂选择性强，即溶解色素的能力强，对其它杂质成分溶解力差。黑色素的萃取运用其溶于碱性溶液而在酸性溶液中形成沉淀的性质;花色昔类黑色素的萃取运用其易溶于水、乙醇等溶剂的性质。

目前，对天然黑色素的萃取方法有水法、醇法和碱法三种。

(1)水法

水法简便，成本低，但选择性差，大量非色素杂质被萃取出，萃取出的色素色价较低，萃取液质量不高。陈祖洪[35]用40-50倍水浸提风香树叶5-6次，时间约为24h，再经浓缩、真空干燥后，即得黑色素产品，得率为13%-15%。王国良[36]将樟木科树叶经粉碎后用60℃-100℃水浸泡2-6h后，过滤，滤液在60℃低温真空下浓缩至浓度为30g/100g-50g/100g,即得产品。

(2)醇法

为了克服水法选择性差的缺点，一些研究人员对花色苷类黑色素采用酸性乙醇法萃取。此法的优点是:花色昔类色素在酸性乙醇溶液中稳定，溶剂选择性高，萃取率也高，安全可靠，常温下不易大量挥发，而又能在较低的加热温度下蒸发。缺点是萃取率低，产品成本高。 王新平等从黑糯米中萃取黑色素，用80%乙醇溶液作浸取剂，调节pH为2，在80 ℃恒温水浴锅中加热40min，然后过滤，真空浓缩，干燥。崔蕊静等[]研究结果表明，黑豆皮红色素最佳萃取工艺是:95%乙醇与O.1g/100g HCL按1:2混合作萃取剂，物料与萃取剂比为1:40(wlv)，温度70℃，浸提时间100min。其得率高于单纯用水或盐酸提取，且颜色亮丽。孙玲等[8 l认为，黑芝麻色素的最佳萃取条件是将黑芝麻粉碎后进行3h脱脂处理，浸提溶剂为酸性醇溶液，浸提温度80℃，浸提时间3d，物料比为1: 50(wlv)，在该条件下，黑芝麻色素的萃取率可大于98.1%。但是，这个结果与黑芝麻色素在pH1-4不溶的性质不符，因此需要进一步实验加以验证。

（3）碱法

此法的优点是:溶剂对黑色素选择性高，溶解力强，萃取率高。

周旭章[3]提出利用氢氧化钠的水溶液萃取黑芝麻色素的方法。在40℃、氢氧化钠的浓度2-4g/100g时浸提:在pH值为2.7--2.0时沉淀分离。其得率在1.3%-1.4%范围内，色价为E=153(340mm处)，萃取色素后得油率仍在60%左右。王恒山等[37]新鲜的桂花种子皮清洗后剥下表皮，粉碎，称取340g放在锥形瓶中，以10g/100g NH3·H2O溶液(pH=10.5 )为提取液，桂花种子皮与提取液的配比为1:5(w/v)，在25℃下静置保温36h,过滤分离，清液用2mo1/L HCL溶液调pH=2.5，使黑色素沉淀，室温静置12h，再过滤分离，即可得到桂花种子皮黑色素粗品。赵肃清等[37]，将变黑了的香蕉皮内层软的部分，置于浓盐酸中放置过夜，过滤，取滤渣用1mol/L的热的氢氧化钠萃取，静置，离心，得黑色素粗品。

1.5天然黑色素的纯化方法

粗制天然黑色素因为含有其它成分，直接影响到色素的稳定性、染色力及应用范围，必须进一步加以分离纯化。分离纯化的方法主要是沉淀法和层析法，层析法包括纸层析、薄层层析、柱层析，以及高效液相色谱法等。

(1)碱溶酸沉法

碱溶酸沉的方法不但可以萃取黑色素，而且可以纯化天然黑色素，酸的水解作用可以去除与黑色素结合的蛋白质、碳水化合物以及脂类物质。

从毛发中萃取黑色素时，先用酸水解蛋白质，使黑色素从结合态转为游离态，并形成沉淀，然后反复用氨水溶解和酸沉淀，得到较纯的黑色素[37]

从香蕉皮和黑芝麻皮中萃取黑色素，先是用10mo1/L的氢氧化钠浸提，然后用6 mo1/L

HCL调pH到酸性使黑色素沉淀，反复3-5次即可得到纯的黑色素。赵肃清等[18]用此法纯化香蕉皮黑色素，最后的沉淀用乙醇洗3 -- 5次，真空干燥后的纯化后的香蕉皮黑色素。

王恒山等[36]均等桂花种子皮黑色素粗品于100℃条件下用1 mo1/L HCL溶液水解2h过滤分离，再分别用三氯甲烷、乙酸乙酷、95%乙醇反复处理沉淀，每一次都用HCl调pH 2.5得到沉淀，并用蒸馏水洗涤，即可得到纯化后黑色素的沉淀。

(2)纸层析法

纸层析是分离天然色素的一种较为传统的方法，具有快速，简便等优点缺点是制备量少。

钟丽玉等[11]采用三次纸层析法得到黑米黑色素的主要花色苷:矢车菊花色素-3-鼠李糖苷和芍药花色素-3-阿拉伯糖苷等5种色素，三次的展开剂分别为BAW12h，正丁醇:2 mol/L盐酸(1:1, V/V )溶液中层析10h，水:醋酸(85:15 ,V/V ) , 15 X 30cm新华三号层析纸，上行法。

(3)柱层析法

柱层析法的优点是制备量大，产品质量好，回收率高;缺点是操作复杂，分离时间长。

张名位等[12]将提取得到的黑芝麻黑色素减压浓缩，过硅胶层析柱，用乙醇-三氯甲烷-水(V/V/V,20/65/15 )洗脱，收集紫红色洗脱液，经浓缩，得色素浸膏，经反复结晶和重结晶，得色素粉末。经分析确定黑芝麻黑色素属于黄酮类花色苷化合物，具有2-苯基-苯并呋喃环结构。张晴等[13]用大孔吸附树脂纯化黑米黑色素，所得黑米色素中花色苷含量达23.7%，色价E1cm1%=83，产品纯度远远高于现行的国家标准。张远志等[16]对板栗壳色素进行聚酰胺柱层析分析，初步确定为二氢黄酮类化合物，并带有取代基团。

1.6黑色素的理化性质

已有研究表明黑米[13]和黑大豆[12]色素是花色苷类黑色素，将它们的部分理化性质与黑芝麻色素作比较，以考察三种色素稳定性的异同。

黑米色素和黑大豆色素在pH值为2 -11条件下，色泽均表现出由红色到蓝紫色和橙黄色的变化特征。黑米色素在pH值为4.0时，呈鲜红色，pH值为4-7时蓝色，pH值>11时色素开环转变成茶尔酮结构，显橙黄色;黑大豆色素在pH值为2-4时呈深红色，pH值为4-7时显橙黄色，pH值为7-11时蓝紫色[12]。

黑芝麻色素在pH值为1-4时不溶，pH值为4-7时紫褐色，pH值为7-11时颜色变深[6,12]。

黑大豆和黑米色素对光的反应较为敏感，黑芝麻色素较稳定，对光的稳定程度:黑芝麻色素>黑米色素>黑大豆色素[12]。80℃以下，温度对三种色素的影响不大，高于80℃则对色素有较大影响，其顺序:黑大豆色素>黑米色素>黑芝麻色素。相对而言，黑芝麻色素对温度的稳定性较强[20]。Al3+, Mg2+能提高三种色素的稳定性，且有一定的增色效果，并且随着浓度的增加而增强，Fe3+对三种色素有减色作用，添加后随着时间的延长，吸光值进一步下降，K+, Na+则对三种色素的影响不明显[21]。

从以上对比发现环境对黑芝麻黑色素的影响比花色昔类黑色素小，黑芝麻色素具有黑色素M的理化特征[17]

1.7黑色素M功能性及应用

黑色素M的光保护、营养和保健价值是引起人们对其关注的一个重要因素。黑色素M除含有普通色素的各种营养成分外，还有显著的光保护性、抗氧化还原性和干扰体内病毒形成等生理活性，显示出它独特的作用。

(1)光吸收

黑色素M多聚物有很多有趣的特性，其中最显著的是由于其高度的共轭效应而产生的广谱吸收特性。这种色素显黑色是其吸收多数可见光的结果，甚至还吸收一些低能量的辐射。可见光范围内的能量转移发生在非键轨道到反键轨道的跃迁中，而黑色素M中有很多C=0键。黑色素M吸收紫外区域的光，能量从成键轨道到反键轨道转移，主要发生在不饱和的碳键中。由于共扼的电子离域效应，使得这种由成键轨道到反键轨道的跃迁更加便利。随着共扼程度的增加，吸收只需要更低的能量，一般称之为红移现象。多数由黑色素M吸收的可见光能量通过光子一声子结合转化为热。含吲哚醌较多的黑色素M(如真黑素)之所以会显得黑一些，主要是由于其在光谱红色部分有很强的吸收，这些低频率的光的吸收主要是通过碳基，而一些含较少碳基的黑色素M(如褐色素)，会显得较黄或较红。其中，最著名的就是鸡羽毛上的红黑色素，它含有多量的硫[38]。

(2)氧化还原性

黑色素M，尤其是真黑色素，表现出显著的氧化还原性，并且由于在醌和多聚物邻苯二酚部分之间的电子离域，使其产生很多半醌自由基。黑色素M可以参与一些单价或双价的氧化还原反应，光吸收的结果使这种色素产生光氧化，使其所含碳基数增加，从而改变黑色素M的吸收特性，即所谓即刻色素变黑反应。

黑色素M的抗氧化性还表现在具有很强的阳离子鳌合特性，主要是通过羧基和轻基这些阴离子起作用的[38]

(3)其它作用

黑色素M前体-儿茶酚、5,6-二经基叫睬、1,8-二羟基萘是广谱抗生素，可以干扰HIV诱导的合胞体的形成，阻止HIV-1膜表面的糖蛋白和T细胞特异单抗与淋巴母细胞的结合[39]

(4)黑色素M的应用

黑色素M具有抗日光、紫外线、X射线、r射线、宇宙射线、核辐射等多种辐射的作用，因此，它具有保护体内细胞免受辐射损伤的功能，即黑色素M的光保护作用。黑色素M的这一性质可用于外表修饰，目前已被广泛应用于生产防晒霜、洗发剂、染发剂和各类防辐射眼镜等。另外，黑色素M在作为半导体和生物杀虫剂的光保护剂等方面也有着广泛的应用前景。

Malgorzata等[39]认为黑色素M除赋予生物体某些特殊防御作用外，它的抗氧化的功能表现在能阻止心磷脂脂质体的氧化。Eric.S.J.等[41]认为真菌黑色素还可抵抗高锰酸钾、次氯酸钾盐及其他氧化物的氧化作用。黑色素M作为新型的天然的药物载体，用来治疗某些与黑色素M缺乏有关的神经系统疾病，如着色性干皮病、帕金森氏症、老年型痴呆症、亨廷氏舞蹈病等。Montefiori等[39]报道，化学合成的可溶性黑色素M还具有抑制HIV病毒感染宿主细胞的作用。天然黑色素M在食品工业上也有广泛的用途，可将它作为酒类、饮料类、婴儿保健品及大众食品等添加剂。例如，提取黑芝麻、黑豆、黑米内的天然黑色素，再配以山野果汁形成黑色饮料，既丰富了营养成分，又保持天然本色。特别是近年来的研究表明，黑色素具有抗氧化和防止衰老等功能，将大大促进天然黑色素M在日益受重视的保健食品工业中的应用。

立题背景和意义

目前，天然色素因其食用安全性越来越受到人们的青睐，在已开发的天然色素中，红色、黄色、绿色等品种较多，蓝色较少、黑色则极为稀缺。当前使用的食用黑色素有亮黑BN和黑色1984，多为合成色素，因此开发天然黑色素具有现实的紧迫意义。从黑芝麻中萃取的黑色素，具有一定的营养价值和药理作用，可添加于食品、医药、保健品等当中，尤其是以这种色素为原料，采用现代先进技术生产的各种功能食品，含有丰富的营养物质和明确的生物活性成分，具有确切的保健作用，易受消费者青睐。

多年来，欧美等国家一直都有开展与黑色素M相关的研究工作，包括一些黑色素M的分离纯化、功能性质、元素组成、结构推导、化学降解研究以及一些与黑色素M相关的免疫学、病理学的研究。平菇在我国各地广有种植，是我国传统的滋补食品，但平菇色素方面的基础理论与应用研究尚处于较低水平，开展平菇色素的萃取纯化及其性质的研究，无论是平菇的高附加值综合利用和深加工开发，还是对色素的药学研究都具有十分重要的实用价值和理论意义。

研究内容

针对我国资源丰富，而深加工技术落后的现状，本文进行以下方面的研究。

1)黑色素萃取工艺的研究;

2)黑色素的纯化及其结构的初步研究;

3)黑色素理化性质的研究;

4)黑色素清除自由基性质的研究。

黑芝麻是由种皮、胚乳、子叶和胚组成的，其中色素全部存在于种皮中，为了尽量减

少杂质分析色素结构，必须将黑芝麻脱皮。据报黑色素为碱溶性色素，不溶于常见的有机溶剂中，因此本文用碱水溶液萃取黑芝麻色素。

本章选用氢氧化钠作萃取剂，对影响萃取效果的萃取温度、时间、料液比、萃取次数

作单因素实验和正交实验，选择最佳萃取工艺条件。

萃取过程中，黑芝麻色素与芝麻蛋白质、碳水化合物、脂质、黄酮类化合物、木质素、

以及其它一些色素杂质一起被萃取出来，得到的黑芝麻色素产品就是与黑芝麻蛋白质等杂

质的混合物，所以将萃取产率和色价共同作为衡量黑芝麻色素萃取效果的工艺指标[13]

平菇中黑色素萃取工艺的研究

用蒸馏水冲洗平菇子实体，将平菇子实体研磨捣碎，加入适量的1mol/lNaOH,100℃水浴提取3 h。4000rpm离心取上清液,用1mol/l HCl 调滤液pH值约2.0再4000rpm离心收集沉淀，即得黑色素粗品。

适量黑色素粗品中加入7 m ol/ L HCl 1 5 m L于1 0 0℃水浴6 h, 4000rpm离心收集沉淀,沉淀用蒸馏水漂洗3次,溶于pH8.0的KOH中。加入一倍体积的氯仿:异戊醇( 1:5 ),上下颠倒数次离心收集上层液体。重复三次操作。将所收集液体用1 m ol/ L HCl调p H 2.0，离心收集沉淀。沉淀用无水乙醇、9 5％乙醇、 70％乙醇梯度洗涤，再离心收集沉淀。沉淀用去离子水漂洗三次，冷冻干燥后存于- 2 0℃冰箱备用。

将所提取纯化的香灰菌黑色素和合成黑色素溶于0.01g/L的KOH中，使黑色素浓度为10 m g /L ，在200—600n m波长范围内进行紫外吸收扫描。经纯化并冷冻干燥处理后的香灰黑色素和合成黑色素，与 K B r 按1:100混合均匀压片后在傅立叶红外光谱仪中扫描分析。（吴尧,马爱民，等.香灰菌黑色素对真菌生长及多酚氧化酶活性的影响.食品科学[J]，2008, 20: 501- 504）

如果吴尧的方法在平菇子实体中能够提取出黑色素，说明平菇中含有这类物质。原方法在HCl浸提过程中对原料及能源消耗太大，流程复杂、时间长、等缺点，不利于提高生产效益。超声波是一种弹性机械波，利用超声振动能量，可以改变物质组织结构、状态、功能或加速这些改变的过程。若将其运用在固液萃取过程中，则可使细胞周围和细胞内产生环流，从而提高了细胞壁和细胞膜的通透性，起到强化萃取过程的作用，有利于细胞内有效成分的提取。尝试研究超声波对黑色素提取的促进作用，使用超声波辅助提取，希望能为改进黑色素提取工艺、缩短提取时间、降低提取成本提供一些依据。（李云雁，宋光森.超声波协助提取板栗壳色素的研究.食品科技[J],2003,57-65）

传统技术路线：

平菇子实体→去杂→粉碎干燥（称重）→溶剂浸提物料比 1：25（1mol/L NaOH,100℃水浴提取3h）→4000rpm离心取上清液→1mol/l HCl 调滤液pH值约2.0→4000rpm离心收集沉淀，即得黑色素粗品（称重，计算得率）

粗品纯化

黑色素粗品→溶剂浸提物料比 1：20（7 mol/ L HCl 15 m L于100℃水浴6 h）→ 4000rpm离心收集沉淀→沉淀蒸馏水漂洗3次溶于pH8.0的KOH中→加入一倍体积的氯仿:异戊醇( 1:5 ),上下颠倒数次→心收集上层液体。重复三次操作。将所收集液体用1 mol/ L HCl调p H 2.0，离心收集沉淀。沉淀用无水乙醇、9 5％乙醇、 70％乙醇梯度洗涤，再离心收集沉淀。沉淀用去离子水漂洗三次，冷冻干燥后得到粉末状色素存于-2 0℃冰箱备用。

而超声波辅助提取工艺流程的浸提过程是在20kHz(40W)超声波场中进行。

试验以1mol/L NaOH溶液为萃取剂，1mol/L NaOH，选取提取温度、pH值、物料比和每次提取时间，按 L9 (34)正交表设计四因素三水平试验，并以色素提取率为试验指标，以确定较优的工艺参数。

参考结果：

香灰菌丝(干重为2.06g )，经处理所得香灰菌黑色素粗品0.85g，黑色素粗品再经一系列纯化处理， 最终得香灰菌黑色素纯品0.68g 。香灰菌黑色素的产量为33.01％(黑色素纯品/100g菌丝干重)。

黑色素组分研究

1. 平菇子实体水分测定 用105摄氏度烘箱法

2. 粗蛋白测定

参考GB5512-85

3. 粗脂肪测定

GB5512-85

4．灰分测定

GB4800-84

5 总糖测定

参考蒽酮比色法，只要有糖基，都可以反应。所以没有专一性，测出来的是总糖，因此样品不能既有糖原又有葡萄糖，这样的话标准曲线就没有意义了。

2.4.3萃取工艺

黑芝麻皮在100℃沸水中煮沸l0min滤去水，皮中按一定比例加入一定浓度的氢氧化钠溶液，在一定温度下萃取适当时间，过滤后得滤液，加盐酸调节pH值1-4之间，使黑色素絮凝，静置12h使其沉降，沥去上层棕色清液，将沉淀压滤分离，用少量水洗涤，蒸发至干便得黑色素粗品[10-12]黑芝麻黑色素得率计算公式如下:

得率(%)=黑色素粗品的质量/黑芝麻皮的质量

2.4.4色价的计算

精确称取自制的黑芝麻色素O.lg，加入少量pH 8.0的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲溶液使色素溶解，全部移入100mL容量瓶中，加入缓冲溶液，定容，摇匀，从中吸取lOmL色素液，移入另外一个100mL容量瓶，用同样的缓冲溶液定容，摇匀，在270nm处测定其吸光值，色价计算公式如下:

采用液质联用 (LC-MS)技术对子实体黑色素花青苷的种类进行了确定

功能鉴定

黑色素的光保护作用

与VC抗氧化能力比较

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/11a9eda4284ac850ad024271.html