动物细胞培养
一、试验目得。
1、掌握无菌操作技术。
2、掌握原代与传代细胞培养.
３、掌握细胞冷冻与复苏技术。
4、了解培养成纤维细胞得形态.
二、试验原理。
将动物机体得组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTＡ）或机械方法处理,分散成单细胞,置合适得培养基中培养,使细胞得以生存、生长与繁殖,这一过程称原代培养。
细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱与,为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代(再培养)。 传代培养也就是一种将细胞种保存下去得方法。同时也就是利用培养细胞进行各种实验得必经过程.悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
对具有移动特性得稳定细胞系或细胞株进行长期保存,一方面可以作为细胞研究得试验材料,另一方面可以做细胞制品得生产材料。目前广泛应用得细胞保存方法就是低温冷冻保存法，。细胞得冷冻保存得原则就是慢冻快融，这样做就是为了防止细胞由于冷冻过程中产生了冰晶而发生细胞破裂．
三、实验器材及药品.
器材:怀孕得小白鼠、培养箱、培养瓶、培养皿、移液器、眼科剪、镊子、酒精灯、离心机、水浴锅、倒置显微镜、CO２培养箱、超净工作台、离心管、高压灭菌锅、试管架等。
药品:小牛血清、DＭEＭ合成培养基、抗生素、DMＳO冷冻剂、胰酶、ＰBS缓冲液等。
四、实验操作。
1、消毒灭菌。
将实验所需用到得工具(如枪头、培养皿、眼科剪、镊子以及每个人得实验服等)集中灭菌、烘干.配制７5％得酒精以备实验时所需。
２、培养基得配制。
分别取10ml得小牛血清、９0ml得DMEM合成培养基,将两种培养基混合在一起，再向其中加入1ml得抗生素,吹打混匀就得到了细胞培养得培养液。
3、原代培养。
(１)、准备。将实验过程中会用到得工具以及药品全部放在超净工作台上进行紫外消毒灭菌。实验开始前带好乳胶手套,用酒精对手进行消毒.将怀孕得小白鼠放在酒精中杀死,取出子宫内得胚胎组织。
（2）、剪切与消化。将胚胎组织放于平板中,用眼科剪将组织块剪碎,剪得越碎越好.将剪碎得组织块放于离心管中，加入大约20０µｌ得胰酶进行消化。也可将其置于37度恒温箱中进行消化。
（3)、分离细胞.消化到一定时间时,如果离心管中得溶液中出现了明显得浑浊,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织已分散成细胞团或单个细胞，则应该加入与胰酶等量得培养液终止消化。离心管于离心机中离心,弃上清液,得到分散得细胞。
(4)、转移细胞并培养．向含有分散细胞得离心管中加入配制好得培养液,吹打混匀，将培养液用移液器移到细胞培养瓶中。置于36、5℃恒温CO２箱培养，瓶口少少拧得松一点。
4、传代培养。
(1)、倒置显微镜下观察细胞得形态.倒置显微镜下观察培养细胞得长势及密度,根据细胞密度决定传代得稀释倍数。
(2)、收集原代培养得细胞。吸出培养瓶中得旧培养液，并用PBS冲洗两遍。然后向培养瓶中加入２０0µl得胰酶进行消化。消化一段时间后用配置好得培养液等比例终止消化。然后离心，收集到原代培养得细胞。
(3）、传代细胞得培养.向离心管内加入大约7—8ml得培养液，吹打混匀。将培养液转移到培养瓶中,置于37度恒温CＯ2培养箱中培养。培养1—2天后于显微镜下观察细胞得形态.
5、细胞冷冻保存。
（1）、收集细胞。吸出培养瓶中得旧培养液,并用PＢS冲洗两遍.然后向培养瓶中加入200µｌ得胰酶进行消化。消化一段时间后用配置好得培养液等比例终止消化。然后离心，收集细胞。
(2)、冷冻。向离心管中加入一定量得培养液以及1０%-20％得DMＳO冷冻液,吹打混匀并转移到冷冻管中.先将冷冻管在4度冰箱中放置１0min,再放在—70度得冰箱中冷冻过夜。
(3)、复苏。将冷冻得细胞取出来后,立刻放在40度水浴中,使其快速融化。并对融化得细胞 进行进一步得观察。
五、实验结果。
传代细胞
传代第一次换液细胞
原代第一次得细胞
原代第四天得细胞
冷冻复苏得细胞
六、实验分析与讨论。
从本次实验得图片可以瞧出来，实验做得还算成功,细胞基本上没有被污染.在做得过程中一定要非常注意无菌操作,这就是决定试验成功得关键因素。在做原代培养得时候,一定要将小鼠胚胎得组织块剪得够碎,确保在用胰酶消化后可以得到分离得单个细胞。在做传代培养时，要把握好胰酶得消化时间。冷冻复苏时,一定要按照步骤进行冷冻，遵循慢冻速溶得原则。
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