注意事项
1. 以下的Protocol主要适用于(1)所使用的DNA1、反转录酶、RNA 酶抑制剂以及dNTPs均是Fermentas公司的;而在qPCR中,所使用的Supermix是Bio-RAD公司的。
2. RT-qPCR中的注意事项:
(1) MgCl2的浓度2~4mM;
(2) 模板的浓度50ng~5pg之间;
(3) 引物的浓度,500nM比较合适,若反应效果不好可以在0.1~1uM之间选择;
(4) 退火温度的选择,首次设置比实际小5℃的,之后在1~2℃选择;
(5) 引物设计的时候Tm值最好在60℃附近,正反向引物的Tm的差值在1~2℃之间;
(6) 抽提得到的RNA,需要验证RNA的纯度,最好验证一下RNA的完整性;
(7) 在qPCR中,模板的体积要小于总反应体系的10%(主要是模板的加入量会影响反应体系中的MgCl2浓度);
(8) 扩增曲线一定要做。通常如果有条件也要做退火温度梯度,以获得最佳的退火温度。另外就是,一块板子上,尽可能取尽量多的样本,而不是基因;
(9) 扩增效率在90~110%的范围内是可以接受的;
(10) 内参基因的选择,尽可能选择与靶基因处于同一信号通路中的内参基因。
3. 有关引物设计
(1) 扩增子长度小于150bp;
(2) 引物Tm的理想值57~60℃;
(3) 3’端最后5个碱基里面G或C的含量少于三个;
(4) GC含量介于20~80%,理想值40~60%;
(5) 避免引物二聚体及自身二级结构;
(6) 避免引物内的自身重复序列;
4. 在一个实验中不论是绝对定量还是相对定量都需要做标准曲线,做标准曲线的方法,以反转录得到的cDNA为模板,用qPCR的引物做PCR得到的产物为模板,产物先稀释10000倍,以稀释后为基底,以10为倍数,稀释7~8个梯度(稀释点越多,稀释倍数越大,数据越精确),做qPCR,然后得到标准曲线。利用标准曲线可以验证下列因素:
(1) 扩增效率; 扩增效率 E=10-1/斜率-1
(2) 标准品的梯度范围;
(3) PCR抑制剂的存在于影响;
(4) PCR仪验证灵敏度。
注:如果使用反转录的试剂盒,那么从反转录开始则会有试剂盒的使用说明书,之后的步骤都按照说明书来!
RNA抽提
1. 收集OD值等于0.2的硫化叶菌(ACVY),清洗细胞!
2. 加入1ml的TRIzol,使用移液枪打匀几次!
3. 室温下,孵育5min;
4. 加入200ul的氯仿(每ml的TRIzol)。用手剧烈震荡15s,室温孵育2~3min;
5. ≤12,000g,4℃离心15min;
6. 小心移取无色相到新的离心管中!
7. RNA沉淀:加入0.5ml的异丙醇(每1ml的TRIzol)。室温下孵育10min;≤12,000g,4℃离心15min(通常情况下,离心之前RNA是可见的)。
8. 洗:移去上清,加入1ml的75%的乙醇(每1ml的TRIzol),轻轻涡旋混匀,≤7500g,4℃离心5min;
9. 稍微的风干RNA(不用风干的太狠),使用50ul的RNA-free Water溶解RNA,用移液枪混匀几次,55~60℃孵育10min,测得浓度,部分溶解的RNA的A260/A280值<1.6.
10. -80℃保存或者是直接使用!
除去RNA中的DNA
1. DNAⅠ处理
37℃条件下孵育60min
2. 加入1μl 的50mM的EDTA,之后65℃孵育10min,主要是用于除去DNA1.
3. 将用DNA酶处理之后的RNA做PCR验证,使用荧光定量的引物做PCR。主要是用于验证RNA中的DNA有没有除尽!
反转录
第一条cDNA的合成:
轻轻混匀,65℃孵育5min,之后放置在冰上5min;
依照下列顺序加入下列物质:
轻轻混匀,并且简单离心,主要是让反应均匀;
42℃孵育60min,之后70℃反应10min
RT-qPCR反应
反应体系组成:
Roche LightCycler LC480 Real-Time PCR system
本文来源:https://www.2haoxitong.net/k/doc/e3c51a3377a20029bd64783e0912a21615797f74.html
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