农杆菌介导转化法的概述

学年第学期

20１4级硕士生生物化学期末论文

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2015年６月20日

农杆菌介导转化法得概述

摘要:自从1983年转基因植物诞生以来,植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大得生物技术领域之一、植物转基因技术就是指把从动物、植物或微生物中分离到得目得基因,通过各种方法转移到植物得基因组中,使之稳定遗传并赋予植物新得农艺性状,如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等、［1］ 

目前,应用于植物转基因较多得方法有基因枪轰击法与农杆菌介导法、由于基因枪轰击得随机性,容易出现突变、丢失与引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物得稳定表达得缺点,而农杆菌介导法就是一种天然得植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中得拷贝数低、遗传稳定,就是最常用得转基因技术[２]。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中,近年来,农杆菌介导转化法在一些单子

叶植物(尤其就是水稻)中也得到了广泛应用。本文对农杆菌介导转化法进行综述。

关键词:农杆菌　转化方法 转化效率

1 关于农杆菌

农杆菌［3—5］就是普遍存在于土壤中得一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性得感染大多数双子叶植物得受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤或发状根、与植物基因转化有关得有根瘤农杆菌与发根农杆菌这两种类型。

１.1  根癌农杆菌

依据Ti质粒诱导得植物细胞产生得冠瘿碱得种类不同,根癌农杆菌可分为4种类型:章鱼碱型(Oｃtoｐine)、胭脂碱型(Nopａlinｅ)、农杆碱型(Aｇroｐｉｎe)与琥珀碱型(Succiｎamopｉnｅ)。 

原始得Ti质粒根据其功能得不同可分为4个区:

1、1。1T—ＤNＡ区(Transfer—DNA regｉon):不同来源得菌株,T—DNＡ得长度在12~24 kb,它就是在农杆菌侵染细胞时,从Tｉ质粒上切割下来转移到植物基因组中得一段DNA,其携带得基因与肿瘤得形成有关,但与T—DNA本身得转移与整合无关。T-DNA上最重要得就是T-DNＡ区两端得边界各为2５ bｐ得重复序列。其中１4 bｐ就是完全保守得,分10 bp(CＡGGAAＴATAT)与4 bｐ(ＧTＡA)不连续得2组.左右2个边界(ＬB与RＢ)就是T—DＮＡ转移所必需得,只要其存在,Ｔ－DＮA可以将携带得任何基因转移并整合到植物基因组中,转移得方向就是从右向左,T—ＤNＡ得右边界在T—DNA得整合中对于靶DNA位点得识别具有重要作用 ,因此,尤以右边界更为重要。

1。１、2毒性区(vｉr区):位于Ｔ—ＤNA以外得1个3０—4０kｂ得区域内,该区段编码得基因虽然并不整合进植物基因组中,但对T—DＮA得转移与整合非常重要。这些基因也称为Ｔｉ质粒编码毒性基因(viｒ)。目前,对章鱼碱型农杆菌Ｔi质粒pTi１５９55与胭脂碱型农杆菌Tｉ质粒pTiＣ58得vｉr区进行了全序列分析,在章鱼碱型Ｔi质粒得vir区发现了8个操纵子,分别为virA-vｊrH,共包括２３个基因(viｒＡ,viｒＢ1—vｉrB1１,ｖirＣ1,virC２,vｉrD1—ｖirＤ4,virE1,vｉrE２,ｖirＦ,vｉrG,vｉrH).而胭脂碱型Ti质粒得vir区不含vjｒF与vｉｒH操纵子,它含有另一个基因tzs ,也有学者认为有大约35个vｉr基因成簇排布于vir区、

１、1、3接合转移区(Cｏn区):该区段存在有与细菌间接合转移有关得基因(tra),调控Ti质粒在农杆菌间转移、 

1、1、4复制起始区(ori区):该区段调控Ti质粒得自我复制、 

在遗传转化过程中除了Tｉ质粒上得基因参与外,还有农杆菌染色体基因、染色体基因包chvA、chvB、aｔt、pscA、chvD以及cｈvB.它们大多编码一些膜相关蛋白,负责细菌向植物受伤细胞趋化移动与帮助细菌附着于植物受伤细胞上。

１。2 发根农杆菌 

　 发根农杆菌(Agｒｏｂacterｉum rhizoｇeｎｅs)含有Ｒi质粒,能够诱导被侵染得植物细胞产生毛发状根。其侵染植物就是将其Ri质粒上得T－DNA插入到宿主植物基因组中,这一点与Ｔｉ质粒相类似。转移机制也类似,所不同得就是viｒ区与T-ＤNＡ区所含基因及其同源性不同。发根农杆菌由于宿主植物损伤部位产生得酚类化合物而附着在植物得细胞壁上,vｉrＡ得产物就是一种跨膜蛋白,进一步激活viｒG得产物、T-ＤNA区得ＴL区具有较高得稳定性,TR区具有与生长素合成有关得基因tmsl与tms2及农杆碱或甘露碱合成基因、ＴR区可进行改造,这样Ｒi通过农杆菌细胞膜特定“孔道”进入宿主植物细胞核,进而使T-DNA整合到植物基因组中。

2  转化过程

农杆菌介导得T-DNA得转移与整合就是细菌与植物细胞相互作用发生生物学效应得过程,兼具原核生物中得细菌结合转移及真核细胞加工修饰得特点。其转化过程［6－８]如下:

２、1  细菌在植物伤口处附着,使受伤得植物组织产生酚类化合物,诱导Tｉ质粒内vir基因得表达. 

在植物受到创伤后,创伤组织得细胞释放出酚类化合物信号, 如乙酰丁香酮(Ａｓ)。当农杆菌接受到此类信号时,其vir区基因可被诱导转录。另一类诱导化合物就是组成植物细胞壁得一些特异单糖,Ａs与单糖可协同诱导Tｉ质粒上vir区基因得表达。Ｖiｒ区基因得活化首先就是从ｖirA基因开始得、VirA蛋白就是一种结合在膜上得化学受体蛋白,可直接对植物产生得酚类化合物感应,其感应部位可能位于胞质区域。VｉrA蛋白得胞质区域有自激酶得功能, 自身被磷酸化激活后,使ViｒＧ蛋白活化。VｉrG 蛋白就是DNA 结合活化蛋白,可以以二体或多体形式结合到vir启动子得特定区域,从而成为其它vir基因转录得激活因子,打开VirＢ、vｉrC、ｖｉｒＤ、virE、ｖirH等几个基因。viｒＣ、ｖirD、virE参与Ｔ—DNA复合体得形成与转移.ChvE可结合一些单糖,也可直接与VｉrA周质区相互作用, 以加强Aｓ对Vir基因得诱导 、

２.2 vir基因表达得产物作用于T-DNA产生T—DNA链,进而转化形成T－DNA复合体,随后在植物及细菌蛋白得共同作用下被摄入细胞核内、 

ＶｉrD基因编码得两个产物VｉｒＤ1与ＶirＤ2直接参与加工过程、VirD1蛋白就是一种拓扑异构酶,可将超螺旋型ＤNA变成松弛型DNＡ.VirＤ2蛋白具有特异剪切单链ＤNＡ 得内切酶活性,它可以识别Ｔ—DＮA底链边界重复序列上得特定位点,并在底链２4 bｐ重复序列与第四个碱基之间切割,将T-DＮA从Ｔi质粒上剪切下来,称Ｔ-链、切开T—DNA后,VｉrD２蛋白与T一链得5’端共价结合,避免核酸外切酶降解T一链.新得Ｔ－DNA底链以此链为模板,从右端产生得DNA缺口处以5’－3’方向进行合成。被取代得旧链游离出来,与许多VｉｒE２蛋白分子结合组成Ｔ-DNA复合体。此外,VirD2作为一个导向蛋白,可以指导整个T－DNA复合体从农杆菌进入到植物细胞核。

２。3 T－DＮＡ整合进入植物基因组并表达产生生物学效应、 

T-DNA整合进宿主细胞基因组,就是转化过程中最重要也最关键得步骤。T－DNA在寄主细胞染色体上得整合就是随机得,但对转录活化区域有所偏好。T—DＮA通过与事先断裂得寄主DＮＡ双链(DSB)发生重组来完成整合,进而进行表达。

3转化方法

　 目前农杆菌介导转化单子叶植物最常用得方法就是共培养法、利用农杆菌与植物离体组织共培养进行转化,一般需要经过严格得组织培养过程以再生植株,因而转化周期比较长、共培养前农杆菌感染愈伤组织得方式有:①将整块愈伤组织浸泡于菌液中静置培养。②将整块愈伤组织浸泡于菌液中摇动培养。③将菌液加至愈伤组织上。通常使用得就是第一种方式。 

现将农杆菌介导得植物遗传转化常采用得方法［9],简要介绍如下:

３。１ 叶盘法 

　 　 选取健康得无菌苗,用打孔器打出叶圆盘,将带有新鲜伤口得叶圆盘与载有目得基因得农杆菌液进行短期共培养,农杆菌通过伤口使携带外源目得基因得Ｔi或Ri质粒进入植物细胞,使外源目得基因整合到植物基因组中。它就是双子叶植物较为常用也较为简单有效得方法。 

3、２真空渗入法 

　 该法转化得健壮植株倒置浸于装有携带外源目得基因得农杆菌渗入培养基得容器中,经真空处理,造伤,使农杆菌通过伤口感染植株,在农杆菌得介导下,发生遗传转化。它就是一种简便、快速、可靠而且不需要经过组织培养阶段即可获得大量转化植株得基因转移方法,具有良好得研究与应用前景。 

3。３ 原生质体法 

　 在原生质培养得早期,将携带外源目得基因得农杆菌与原生质体共同培养,农杆菌得Ti或Ri就会随着外源信号分子得诱导而导入原生质体得核内,Ｔ－ＤＮＡ就可能整合在受体基因组上。 

此外,作为载体法,新得转基因方法有:基于Ａｃ/Ｄs转座系统建立得转化载体;利用噬菌体P1Cre－lｏx位点得特异性重组系统;利用酵母线粒体Ｉ-Scel核酸内切酶特异性诱导植物DNＡ双链断开引起得同源重组系统;利用双链细菌人造染色体载体系统等,能够提高转化率或转基因位点质量、

4 研究现状

关于禾谷类单子叶植物农杆菌介导得遗传转化,早期得研究多采用其幼胚来评估不同条件下被农杆菌侵染得可能性。结果显示,T-ＤNＡ向禾本科植物中得转化没有明显障碍,但人们对整合过程得了解十分有限,同时存在相当大得争议。在此基础上,人们利用大量实验去测试不同谷类植物得不同外植体对农杆菌侵染得反应能力,以期获得稳定得转化细胞或植株、Grimｓlｅy等(1987)首先将玉米条纹病毒(ｍaiｚe stｒeak ｖiｒus)得cDＮA通过根癌农杆菌转入玉米,转入植株表现出感染症状;Gｏuld等(1991)用根癌农杆菌感染玉米芽尖,得到少量转基因植株;Sｈen等(19９3)观察到农杆菌介导得gus基因转入玉米芽后β－葡糖苷酸酶得表达;Mooney等(１９91)采用根癌农杆菌感染小麦胚得到转化细胞;Raiｎer等(１990)与Cｈan等(１9９2)通过根癌农杆菌感染未成熟胚得到少量水稻转基因植株。以上研究工作得到得转化频率很低,且没有足够得分子与遗传证据,这些研究成果很少为大家接受并承认,却就是鼓舞人心得,为单子叶植物尤其就是禾谷类作物转基因研究得进一步开展奠定了基础。１993年—19９4年取得了重大突破,Ｃhaｎ等(１993)以水稻开花授粉后10-1２天得幼胚为受体,经农杆菌感染后获得了转基因植株;Hiｅi等(1997)以水稻成熟胚愈伤组织与未成熟幼胚为受体,获得了较多有严格分子生物学证据得转基因植株,并对农杆菌介导法转化水稻得影响因素进行了详细研究,建立了比较成熟得农杆菌转化水稻得技术体系,为农杆菌介导法转化单子叶植物开辟了先河、从此,农杆菌介导法得转化范围扩展到了许多重要得单子叶植物,包括香蕉、玉米、大麦、小麦、甘蔗、大蒜、洋葱、高梁与黑麦(Chengeｔ al 1９97;Isｈidａ et al 199６)［10—13］。

５ 存在问题与展望

5。1植物受体因子与农杆菌间得作用机理 

目前对农杆菌介导转化得机理及分子调控已研究比较深入,但对有关植物因子得作用机理还知之甚少。许多研究表明,农杆菌介导单子叶植物遗传转化已具备了与双子叶植物相似得农杆菌本身得必要条件,但单子叶植物得转化相比较而言困难得多,这可能不仅就是农杆菌一方得因素,单子叶植物得植物因子也可能起着关键作用,也不排除农杆菌与这些植物因子得相互作用［14]。

5。2 转化率 

　 　 大多数单子叶植物得转化受其基因型、外植体来源、组织培养难易程度等因素得影响,比较难,以至在重要禾谷类作物中得应用受到一定得限制,与双子叶植物相比,农杆菌转化单子叶植物还存在较大差距,其中烟草、葡萄等双子叶植物得转化效率高达60％以上,而单子叶植物中转化效率较高得禾本科植物还不到30％(蒋玉宝等２０05;孟芮等2006)。据统计,单子叶植物用农杆菌转化获得成功得遗传转化率玉米为5％—３0％、水稻为29％、籼稻为２2％,接近双子叶植物(任永霞等20０5) ［１5］、目前农杆菌介导遗传转化得方法主要有原生质体法、叶盘法与整株感染法等。对于大多数单子叶植物得转化,常受基因型、外植体来源、组织培养难易程度等因素影响而很难成功,因此在许多重要禾谷类作物中得应用受到限制、 

5、3 Ti载体容量 

　 禾谷类作物得一些性状,如抗病、抗虫、抗逆、高产优质等,或就是数量性状,或就是质量性状相关得基因成簇排布,定位在较大得DＮA片段、这些性状得改造就需要一个能将大片段DNA导入植物细胞并稳定表达得转化体系。能携带大片段DNA得双元细菌人工染色体与具转化功能人工染色体分别对烟草与拟南芥得成功转化(Hamiltｏｎ et al 19９7;Lｉu et al 1999),无疑对实现禾谷类作物中导入大片段DNＡ并进行遗传改良具有重要意义(李卫等２０00)、 

　农杆菌介导得遗传转化也存在不足［1５—1６］。如农杆菌感染过程会对植物材料造成损伤,T－ＤNＡ整合时其边界可能会发生截断(Hamｉd et al 1996),T—ＤNA以串连形式整合,基因依赖性较高(Leｅ eｔ al 19９9),甲基化等原因造成基因表达失活(Kｕmpalｔa et al 199７,19９８;Ｐawｌowsｋi ｅｔ al 1998),转移Ｔ-DNA区得两个基因未必共表达等(Hａｍid et al 1996)。 

另外,考虑到转基因作物及其产品得安全性问题,培育具有安全选择标记或无选择标记得转基因植物也将成为植物基因工程研究得热点之一、

6 结束语

随着转基因技术得迅猛推广,农杆菌介导植物遗传转化在转化机理、转化范围、转化方法、转化策略等方面得进一步深入研究,农杆菌介导法已在植物转基因领域中被广泛应用,成为获得转基因植物最常用得方法。

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本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/de0afc150875f46527d3240c844769eae109a3c8.html