细胞实验教案1

细胞生物学实验教案

实验一细胞核与线粒体的分级分离

一、实验目的

了解差速离心法分离细胞器的原理，以及练习使用差速离心法分离哺乳动物的细胞核与线粒体。

二、实验原理 

   细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。分析 分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。

  三、细胞核的分离提取

  (一)操作步骤

  1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。

  2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。

  3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。

  4．将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟；(1)缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；(2)同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥；(3)余下的沉淀物进行下一步骤。

  5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。

  6．将①、②、③涂片用l％甲苯胺兰染色后盖片即可观察。

  (二)结果

  分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。

  四、高速离心分离提取线粒体

  (一)操作步骤

  1．将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17000rpm离心20分钟，弃上清，留取沉淀物。

  2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化钙液lml，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液混匀成悬液(可用牙签)。

  3．取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、⑤涂片)，各滴一滴0.02％詹纳斯绿B染液盖上盖片染20分钟。

  (二)结果

  油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。

作业

光镜或油镜下观察制备的细胞核与线粒体样本。

实验二细胞膜的通透性观

一、实验目的

1. 掌握细胞膜通透性的实验方法。

2. 观察并掌握相对分子量、脂溶性大小、电解质和非电解质对细胞膜通透性的影响。

二、实验原理

细胞膜在不断变化的环境中必须保持自身的稳定状态才有生存。细胞膜允许一些物质通透，又能降低甚至阻止另一些物质的通透，所以细胞膜具有选择通透性。

水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。

将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。

在不同相对分子量、脂溶性大小以及电解质和非电解质等各种溶液中，红细胞质膜对各种溶质的渗透性不同。由于溶质透入速度不同，溶血时间也不同。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验通过观察红细胞溶血现象时间的不同来记录渗入速度，从而测量各种物质通透性的差别。

三、实验用品

1. 实验材料

血液（兔血或鸡血，含适量肝素）

2. 仪器

50mL烧杯、10ml试管、试管架、移液枪及枪尖，标签纸、吸水纸等。

3. 主要试剂

0.17 mol/L氯化钠 0.17 mol/L氯化铵 0.17 mol/L醋酸铵

0.17 mol/L硝酸钠 0.17 mol/L草酸铵 0.12 mol/L硫酸钠

0.32 mol/L葡萄糖 0.32 mol/L甘油 0.32 mol/L乙醇

蒸馏水

四、实验方法与步骤

1. 制备10%血红细胞悬液：把一份动物血液和10份0.17M氯化钠溶液加入到50ml烧杯中即为稀释的血红细胞悬液（不透明的红色液体）。

2. 溶血实验：取0.3ml动物红细胞悬液加入到3ml蒸馏水的试管中，晃动试管使之混合均匀，注意观察溶液的颜色变化，溶液由不透明的红色变为透明的红色，红细胞发生破裂，造成100%红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。记录发生溶血（可以通过试管壁看清实验指导上的字为标准）的时间（自加入稀释血液到溶液变成红色透明澄清所需的时间）。

3. 红细胞的渗透性：取10支试管，分别加入3ml不同的等渗溶液，做好标记后，分别加入0.3ml红细胞悬液，轻轻振荡，仔细观察是否发生溶血并记录发生溶血的时间。

五、实验结果

将不同等渗溶液下的溶血现象列表，分析（是否发生溶血以及溶血发生的时间、原因）。

六、思考

脂溶性与水溶性、小分子与大分子、极性与非极性、带电荷与不带电荷物质，分别是哪一种更容易穿过质膜？

七、注意事项

1. 溶血现象可用一张有字的白纸来辅助识别，能够清楚地透过溶液看到溶液后方纸上清晰的字迹时，为完全溶血。

2. 因相对分子质量大小对膜通透性有影响，所以将溶血时间适当地延长至15min，15min时仍然不溶即判断为不溶血。

3. 注意同组实验过程的同步性，尤其滴加血液的操作要迅速。

4. 试管中有红细胞和测试溶液时，不要强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。

5. 各试管中加入的试剂量一致，血量也要一致。

实验三 细胞形态结构与几种细胞器的观察

一,实验目的 

在普通光学显微镜下识别细胞和细胞器的形态结构,掌握生物绘图的方法. 

二,实验原理 

细胞在形态上是多种多样的,有球形,椭圆形,扁平形,立方形,梭形,星形等.虽然细胞的形状各异,但是它们却有共同的基本结构特点,都由细胞膜(动物),细胞壁(植物),细胞质和细胞核组成.细胞中的各种细胞器,如线粒体,高尔基体,中心体,核仁,染色体等,一般经过一定固定染色处理后,大多数在光学显微镜下是可以看见的.细胞器的形态结构在普通光学显微镜下与电子显微镜下所看到的结构有很大的差别.

三,实验材料 

洋葱根尖切片 

小白鼠肝切片 

兔神经节切片 

马蛔虫受精卵切片 

四,实验内容

(1)洋葱根尖切片细胞的观察 

先用低倍镜观察根尖的纵切面,注意分生区,伸长区,成熟区细胞的异同,然后再仔细观察细胞的形态结构,特别要注意细胞的形状,大小,以及细胞壁,细胞核,核仁,细胞质,液泡的形态结构. 

(2)兔神经节细胞切片高尔基体的观察 

先在低倍镜下找到兔神经节细胞,然后转用高倍镜观察,可看到细胞内淡黄色的背景上有黄褐色或者透明的细胞核,核的周围分布着许多深褐色的(硝酸银镀染)高尔基体,呈弯曲的线状,颗粒状,少量分散在细胞质.

(3)小白鼠肝细胞切片线粒体的观察 

先用低倍镜后用高倍镜观察,可见到许多肝小叶,每小叶有许多紧密排列成索状的多角形的肝细胞,细胞中央有大而圆的细胞核.这时,转用油镜观察,可见到细胞质内分布着许多被苏木精染成深紫色的线粒体,呈颗粒状和线状. 

(4)马蛔虫受精卵切片中心体的观察 

取马蛔虫受精卵切片,在显微镜下找到充满子宫腔的受精卵,每个马蛔虫受精卵外围有一层较厚的卵膜,膜内有宽大的围卵腔,各围卵腔内有处在不同分裂期的卵细胞.找到分裂中期的细胞,在细胞中央被染成蓝色条状或棒状的结构,这就是染色体.在染色体两侧可见各有一个较小的,亦被染成蓝色的小粒,称中心粒.在中心粒的周围可见呈放射状的星丝. 

作业

图一, 洋葱根尖细胞图

图二, 兔的神经细胞中高尔基体

图三, 小白鼠肝细胞切片示线粒体

图四, 马蛔虫受精卵切片示中心体

生物绘图应注意的问题 

1.绘图前,先要把显微镜下的图象观察清楚,再根据绘图的要求,安排好图纸的布局,必须养成两眼打开观察的习惯. 

2.绘图时要注意科学性和真实性,看到什么绘什么,不要随意增多或减少,图的各部分比例要恰当. 

3.要保持图面的清洁,整齐,尽量少用橡皮擦.图的各部分标记要清楚,要用细的直线标示在图的右边,字体要端正.细胞中的生活部分或明暗部分可用疏密圆点表示. 生物绘图是不能涂的.

实验四细胞的无丝分裂与有丝分裂

一.实验目的

1.通过实验掌握无丝分裂和有丝分裂的基本过程和生物学意义，并比较它们两者有何不同。

2.通过观察洋葱根尖的有丝分裂标本，掌握细胞有丝分裂前、中、后、末期的染色体形态变化特点。

3.通过观察马蛔虫受精卵的有丝分裂标本，比较植物细胞和动物细胞有丝分裂过程的不同点。

二.实验物品

1.材料：草履虫无丝分裂装片、洋葱根尖切片、马蛔虫装片，洋葱根尖。

2.器材：

每组配备：眼科镊和眼科剪各2把，皮头吸管1支，5ml烧杯2个，载玻片（每人一片），盖玻片，擦镜纸，吸水纸，擦镜液。

3.试剂：1mol/L HCl（60℃预热）， Carnoy固定液（甲醇3∶1冰醋酸），95%、85%、70%酒精。蒸馏水、改良苯酚品红染液。

三.实验步骤

(一)草履虫无丝分裂切片观察

草履虫可进行无性生殖（无丝分裂）和有性生殖（接合生殖）。在无性生殖时，可在显微镜下看到草履虫胞体被染成粉红色，细胞核染成紫红色。分裂时草履虫大核向胞体两端伸长，进而在核的中部向内凹陷，呈哑铃形。然后断开形成两个细胞核，同时胞体也随之延伸，中部出现分裂沟，最后完全分裂成两个子细胞。

(二)洋葱根尖有丝分裂观察

1.材料发根：待根长达2厘米时，切下根尖，浸入Carnoy固定液中4h，分别在95%和85%酒精中各浸泡30 min，最后在70%酒精中保存。

（此项实验前准备）

2.水解：取出根尖放在载玻片上，滴加1mol/L HCl（60℃）于根尖上，水解8 min，蒸馏水水洗3次（将酒精洗去，以利于染色）。

3.染色：切取根尖的乳白色的分生区，用镊子轻轻地捣碎，滴一滴改良苯酚品红染液，染色20 min后，盖上盖玻片。

4.压片：在盖玻片上面覆盖一张吸水纸，用拇指垂直压下，再用铅笔橡皮头轻轻敲打，使细胞压成均匀的薄层（敲打时，勿使盖玻片移动）。

5.观察：

先在低倍镜下找出根尖末端，从根尖末端往上依次为根的根冠区、生长区和伸长区（图18-1）。选择生长区的细胞观察，可见这一部位的细胞染色较深，紧密排列成一行行的四方形。小心移动标本，选择处于分裂状态最多的部位转高倍镜观察，便可见许多处于不同分裂时期的细胞。

间期：间期细胞较小，可清晰看到染色均匀的细胞核，核内有一个染色较深的圆形小体为核仁。

前期：细胞从间期进入前期时，细胞核膨大，染色质逐渐螺旋形成细线状的染色体。随着染色体不断螺旋缩短变粗，可见每条线状的染色体是由两条姐妹染色单体组成。前期末，核仁解体，纺缍丝出现，核膜、核仁完全消失。

实验 鸡血细胞的体外融合

【实验目的】

了解乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合的基本原理。

通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。

【实验原理】

细胞融合（cell fusion）又称体细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞（hybrid cell）。细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。依据融合过程采用的助融剂不同，细胞融合可分为：①病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒（hemagglutinating virus of Japan,HVJ）;②化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）;③电场诱导的细胞融合；④激光诱导的细胞融合。

PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子质量的多聚体。PEG可改变各类细胞的膜结构，是两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，引发细胞融合。该方法应用相对分子质量为400～6000的PEG溶液引起细胞的聚集和粘连，产生高频率的细胞融合。融合的频率和活力与所用PEG的相对分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。

【实验仪器、材料和试剂】

仪器、用具：注射器、刻度离心管、离心机、血细胞计数板、水浴锅、滴管、显微镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、酒精灯等。

材料：成年家鸡。

试剂

1）0.85%NaCl溶液。

2）GKN液：8.0g NaCl，0.4g KCl，1.77g Na2HPO4·2H2O,0.69g NaH2PO4·H2O,2.0g 葡萄糖，0.01g 酚红，溶于1000ml重蒸水中。

3）50%（m/V）PEG溶液：

①取50g PEG(相对分子质量=4000)放入100ml瓶中，高压灭菌20min。

②让PEG冷却至50～60℃，勿让其凝固。

③加入50ml预热至50℃的GKN液，混匀，置37℃备用。

4）Hanks原液（10×）：

NaCl 80.0g

Na2HPO4·12H2O 1.2g

KCl 4.0g

KH2PO4 0.6g

MgSO4·7H2O 2.0g

葡萄糖 10.0g

CaCl2 1.4g

称取1.4g的CaCl2，溶于30～50ml的重蒸水中。

取1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先放重蒸水800ml于烧杯中，然后按上述配方顺序，逐一称取药品。必须在前一药品完全溶解后，方可加入下一药品，直到葡萄糖完全溶解后，再将已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水至1000ml。

5）Hanks液：

Hanks原液 100ml

重蒸水 896ml

0.5%酚红 4ml

配好的Hanks液，分装包扎贴上标签，经过灭菌后，4℃保存。

6）詹纳斯绿染液。

【方法与步骤】

鸡血细胞的获得

从家鸡的翼根静脉用注射器采血，注入试管后，迅速加入肝素（100U肝素/5ml全血）混合，制成抗凝全血。

鸡血细胞储存液的制备

在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85%NaCl溶液，制成红细胞储备液，置于4℃冰箱内可供一周内使用。

鸡血细胞悬液的制备

取鸡血细胞储备液200μl，加入800μl 0.85%NaCl溶液，混匀后，1200r/min离心5min，弃去上清液，再加入1000μl 0.85%NaCl溶液按上述条件离心一次。最后，弃去上清液，加入2000μl的GKN溶液制成鸡血细胞悬液。

计数

取100μl鸡血细胞悬液，加700μl的GKN溶液进行稀释，在血细胞计数板上计数。若细胞浓度过大，用GKN溶液稀释至1×107个/ml 左右。

鸡血细胞的收集

吸取200μl鸡血细胞悬液放入离心管中，加入800μl Hanks液混匀，1000r/min离心5min。弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。

PEG诱导细胞融合

吸取100μl 37℃的50%PEG溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边加边轻摇离心管，使PEG与细胞混匀，然后在37℃水浴中静置2min。

终止PEG作用

缓慢加入1mlHanks液，轻轻吹打混匀，于37℃水浴中静置5min。

制备细胞悬液

用吸管轻轻吹打细胞团数次使细胞团分散，1000r/min离心5min，使细胞完全沉降。弃去上清液，加Hanks液，再离心一次，弃多数上清，留少许溶液，混匀。

滴片、染色和镜鉴

用镊子取预先冰冻的干净载玻片，迅速滴上2—3滴细胞悬浮液，用玻片从载玻片的一边推到另一边，使细胞分散均匀，然后置酒精灯上微微加热干燥。

将晾干的玻片放在洁净的玻板上，用Giemsa染液[Giemsa原液用10倍体积的1/15mol/L磷酸缓冲液（PH7.4）稀释]染色30min，自来水冲洗，空气干燥。在显微镜下观察细胞融合的情况。

计算细胞融合率

细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞其细胞核总数与视野内所有细胞（包括已融合细胞）的细胞核总数之比，通常以百分比表示，而且要进行多个视野测定；进行统计分析。

【注意事项】

本实验中，用0.85%NaCl液代替了Alsver液。实验证实，用Alsver液保存的红细胞时间较短，而改用生理盐水则明显延长红细胞的保存时间且不影响细胞融合率。

高Ca2+浓度能够提高细胞融合率。有些抗凝剂中含有和Ca2+结合的化合物，比如Alsver液中柠檬酸钠的酸根与血液中的Ca2+形成难解离的可溶性络合物，导致血液中的Ca2+浓度降低，故起抗凝血作用，同时会造成细胞的融合率较低。

必须严格控制PEG的作用时间，通常处理细胞1～2min。PEG和二甲基亚砜（DMSO）并用，可以提高细胞的融合率。

融合细胞继续培养就变成了一个杂种细胞，它的染色体不是两核的倍数，因为一些染色体会逐渐的消失。

【作用】

画出观察到的融合细胞，并计算融合率。

试说明细胞融合的关键。

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/d8b563edc281e53a5902ffd0.html