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发布时间：2014-10-18 21:54:15 来源：文档文库

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酪氨酸为基础的信号介导LRP6的内吞作用和Wnt基因/β-catenin信号脱敏

背景：LRP6是一个重要的Wnt/β-catenin共受体信号，控制各种生物途径。
结果：LRP6酪氨酸突变体显示出更长的半衰期和升高的脂质筏分布，磷酸化，和信令。
结论：LRP6的网格蛋白介导的内吞作用介导了它的降解，而小窝依赖的途径促进的Wnt/β-catenin信号。
意义：了解基本的LRP6内吞作用和Wnt基因/β-catenin信号通路的分子机制将有助于这一目标的治疗方法的途径的发展。

摘要
Wnt/β-catenin信号编排的一些关键事件，包括发育过程中细胞的生长，分化和细胞存活。该途径的错误调节导致多种人类疾病，尤其是癌症。内吞作用和磷酸化低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6），一个重要的共受体的Wnt/β-catenin信号通路，在介导的Wnt/β-连环蛋白信号转导中发挥至关重要的作用。然而，其调控机制尚不完全清楚。在这项研究中，我们定义了它的LRP6内吞交易调节的Wnt/β-catenin信号通路的激活机制。我们表明LRP6突变体有缺陷基于酪氨酸的信号在其胞质尾区具有增加细胞表面的分布和内吞作用速率的降低。这些变化在LRP6内吞作用与对小窝的分配增加，磷酸化增加，以及Wnt/β-catenin信号增强一致。我们还表明，治疗的Wnt3a配体或阻塞的LRP6引导的网格蛋白介导的内吞作用，导致对受体脂筏以野生型的再分配。相比野生型LRP6信号激活，Wnt3a刺激LRP6酪氨酸突变体也表现出增加的响应，并且当胞膜窖介导的胞吞作用被阻止这种激活就被抑制。我们的研究结果揭示了其中的LRP6内吞途径调节其磷酸化的Wnt/β-catenin信号强度的分子机制，并就如何实现这一途径能在人类疾病中被调制的影响。

Wnt信号/β-catenin信号通路调控胚胎发育过程中的各种活动，包括细胞增殖，存活，迁移和极性，规范细胞的命运，和自我更新（1-3）。因此，异常的Wnt/β-catenin信号导致胚胎发育以及多种人类疾病，如癌症（4）和阿耳茨海默氏病（5）的缺陷。 Wnt信号系列包括19种分泌糖蛋白（6）从事两种细胞表面受体 –跨膜受体（FZ）家庭（7）和低密度脂蛋白受体（低密度脂蛋白）相关的蛋白质5/6（LRP5/6）（8）。Wnt刺激诱导的LRP5/ 6的磷酸化，这导致糖原合成酶激酶3β（GSK3β）介导的β-连环蛋白磷酸化的抑制（9,10）。因此，β-连环蛋白积聚和易位至细胞核，在那里它激活靶基因的表达（1,11）。
细胞表面受体的内吞作用的信号传导具有重要的调节活动，包括的Wnt/β-catenin信号（12,13）。研究表明，该网格蛋白介导的通路在通过下调跨膜信号受体（14,15）终止细胞信号传导有一个关键的作用。在某些情况下当信令持续活性，然而，受体可经历连续几轮的内吞作用和再循环，从而保护受体的降解（16-18）。网格蛋白的内化大多发生在脂筏，这是膜微，由胆固醇和糖脂（19）的动态组装。小窝蛋白介导了一些网格蛋白独立的事件，形成于脂筏膜内陷小窝（20）。这一途径已被证实通过促进受体的吸收和内胞膜窖（21,22）的信号分子，起到受体介导的信号传导的平台的作用。细胞表面受体的细胞膜和胞吞区室之间的流量包含其胞质尾区，使它们有效地招募到内吞囊泡内的信号。几类细胞内吞作用的信号已经鉴定了靶表面蛋白以网格蛋白包被小泡（23）。初步确定在低密度脂蛋白受体和转铁蛋白受体以酪氨酸为基本成分的基序NPXY或YXXØ（其中X可以是任何氨基酸和Ø为氨基酸有庞大的疏水基团）中的胞质尾区中的（24）。此外，丝氨酸残基的配体诱导的磷酸化也可作为受体的内吞作用的信号，显然为了G蛋白偶联受体家族（25）的成员。
LRP6包含其胞质区域内的多个潜在的内吞作用的基序，其中包括两个基于酪氨酸的信号和5个保守的PPP（S / T）p的基序，对于Wnt/β-连环蛋白信令其磷酸化是必要的（
10）。因此，我们推测，在LRP6的胞内结构域的特定序列基序调节其细胞内吞作用和信号转导。在这里，我们使用独特的LRP6突变体定义了LRP6的内吞作用，磷酸化和Wnt基因/β-catenin信号通路潜在的机制。

实验步骤
的LRP6的野生型和突变体的克隆 - 通过使用的QuickChange诱变试剂盒（Stratagene）的定点诱变产生LRP6突变，根据制造商的说明。所有构建体都经测序验证。 LRP6 WT和突变体，其中每个都包含的HA标记，在它的N末端，然后克隆到FLP-在表达载体（Invitrogen）中。当重组酶介导的DNA重组，LRP6在一个特定的位置整合进基因组。
细胞培养和试剂 - FLP-在HEK293细胞（Invitrogen）中均保持在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中含有葡萄糖（4.5克/升），L-谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素和补充有10％FBS中。为稳定克隆的产生，与野生型（WT），在pcDNA5/ FRT表达载体的LRP6突变体转染到FLP-在使用Fugene 6转染试剂（Roche）的HEK293细胞。 48小时后，将细胞分成15平方厘米菜。后附着于培养皿的细胞，新鲜培养基中潮霉素B（100μG/毫升），用于选择抗性细胞，其中基因构建体已整合到FLP-在现场。将细胞分别饲喂选择培养基，每5天，直至菌落可被识别。 10-15个人的稳定克隆的LRP6野生型和突变型各挑取扩增作进一步鉴定。进站2从Abcam公司获得。人类CAV-1的siRNA从Dharmacon公司购买。为了分离脂筏相关蛋白，聚焦全球蛋白质分级套件（G-Biosciences公司）按照制造商的说明使用。
流式细胞术 - 细胞通过非酶细胞解离溶液（Sigma）分离。对于总的LRP6分析，将细胞用PBS中的0.1％皂素之前孵育抗体处理30分钟。对于细胞表面的LRP6，细胞与初级抗体不透。连续培养用抗HA抗体（30微克/毫升）对HA-LRP6和抗小鼠的Alexa Fluor 488（Molecular Probes公司）均在4℃进行1小时。作为对照，背景荧光强度进行了评估在不存在第一抗体。所有的测量都在FACSCalibur（BD公司）进行。使用CellQuest软件和平均值生成直方图，后的对照减法，进行样品间的比较。
测定LRP6半衰期 - 细胞与放线菌酮（CHX100微克/毫升，Sigma）中，以抑制蛋白质合成。在温育0，0.5，1，2，4或8小时后，将细胞裂解，并进行Western印迹。
抗体的吸收和免疫荧光染色 - 使用的Alexa Fluor 488蛋白标记试剂盒（分子探针）抗-HA抗体进行标记。细胞在聚-D-赖氨酸包被的玻璃底培养皿（MatTek公司）中培养，在37℃下进行实验前至少24小时。将细胞在4℃下温育与Alexa488-HA抗体1小时，转移到37℃0，15，30，60，120分钟以诱导LRP6内化。温育在37℃后，将细胞用4％多聚甲醛（PFA）进行20分钟。对于免疫荧光染色，将细胞用PBS洗涤并用4％PFA的PBS中20分钟，在室温下进行。然后将细胞用封闭缓冲液（含0.5％BSA的PBS），并透化，用PBS含有0.2％的Triton X-100。然后，将细胞与初级LRP6或EEA1抗体，在室温下2小时，然后1小时一个的Alexa Fluor缀合的第二抗体（Molecular Probes公司）。细胞表面的LRP6染色不透。染细胞共聚焦激光扫描荧光显微镜（;卡尔蔡司型号LSM510翻转）被看到。量化的细胞表面LRP6的含量，每WT或突变体的样品10-12字段被选中，并且荧光强度由图像J.测定
内吞作用的动力学分析 - 受体介导的内吞作用的动力学分析进行与先前（26）中描述。简言之，将细胞在聚-D-赖氨酸包被培养的12孔板中24小时，实验前。细胞用冷PBS洗涤两次，然后在0.5ml冰冷的配体结合缓冲液（含0.6％牛血清白蛋白的DMEM）中含有1nM的125I-MESD1小时温育。结合后，预热的结合缓冲液加入到细胞中，将板置于37℃水浴中放置0，5，10，20，30，60分钟，开始内化。然后将板置于冰上，并且在配体结合缓冲液置换为冰冷的停止/条溶液（PBS，pH值为2.0）。配体保留在细胞表面，通过孵育细胞单层用共计10分钟，计数冰冷停止/条溶液汽提两次。细胞单层，然后溶解，用低SDS裂解缓冲液（6.25毫摩尔Tris pH值6.8，0.2％SDS，10％甘油，和溴酚蓝）以释放内化的放射性。内化的配位体的总和加上那些经过每个测定被用作最大潜在内化的表面上。在每个时间点内化的配体的分数，计算和绘图。
免疫共沉淀 - 裂解细胞和溶胞产物预清除为至少2小时，用蛋白A琼脂糖珠，然后与在4℃的抗体过夜。的免疫复合物沉淀和蛋白A琼脂糖珠1小时，洗涤3次，用PBS，并煮沸中含有β-巯基乙醇的SDS样品缓冲液中。上清液进行SDS-PAGE和Western印迹。
免疫印迹 - 裂解细胞，在含有PBS中的1％的Triton，蛋白酶抑制剂混合物（Roche）和1mM PMSF在4℃下进行30分钟。等量的蛋白质经受7.5％，12.5％或4-15％的SDS-PAGE，并转移到的Immobilon-P膜（Millipore）。封阻膜在PBS中的5％无脂奶粉和0.05％吐温20，并进行温育以初级和次级抗体。膜探测与辣根过氧化物酶偶联的第二抗体（玛西亚）中的可视化通过ECL检测系统（Pierce公司制）和胶片曝光。凝胶图像进行扫描以ChemiDoc成像系统（Bio-Rad公司），并量化。在一些实验中，膜被用探针LI-COR IRDye二级抗体并用Odyssey红外成像系统（LI-COR）的检测。该下列抗体在该研究中使用：LRP6，磷酸化的LRP6（Ser1490），胱冬酶原-3和裂解的caspase-3的抗体（细胞信号传导），β-连环蛋白抗体（BD Pharmingen公司，细胞信号传导），转铁蛋白受体（Invitrogen）中，窖蛋白-1（Santa Cruz公司），肌动蛋白和网格蛋白抗体（Sigma公司）。
质膜的分离 - 表达WT和突变体LRP6裂解细胞，以0.25毫升含0.4％的Triton X-100的冰冷的TNE缓冲液，1mM的PMSF，鸡尾酒蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。然后将细胞匀浆用Dounce匀浆（40杆），并通过25号针头传代。每个溶胞产物（0.25毫升）中，用0.25毫升80％的混合（重量/体积）蔗糖的TNE和覆盖用1ml35的TNE％蔗糖，接着在TNE0.5毫升5％的蔗糖。的梯度，在TLS55转头（Beckman，USA）离心54,000 rpm离心16小时，在4℃下。 120μL的馏份从渐变的顶部收集。等分试样进行SDS-PAGE和探测用所示的抗体。
实时定量PCR技术 - RNA的共有来自FLP-HEK293细胞中表达WT或使用Trizol（Invitrogen）和RNeasy Mini试剂盒（QIAGEN）突变体的LRP6分离的反转录与标第一链合成系统（Invitrogen公司）。将反应混合物进行定量实时PCR（QRT-PCR）来检测LRP6的表达水平。所有引物进行实时PCR从SABiosciences订购。一式三份的反应，用含铂的SYBR Green qPCR的超级混合UDG（Invitrogen）的25微升混合物。实时定量是在Bio-Rad公司iCycle的iQ系统执行。所有数据均标准化为内源性肌动蛋白的表达。
GST-E-钙粘蛋白下拉测定 - 测定法进行与前面（27）中描述。裂解细胞，在4℃下30分钟。蛋白浓度的溶胞产物进行定量，并且等量的来自不同样品的总蛋白质中，在4℃下温育GST-E-钙粘蛋白的Sepharose珠4小时。温育后，将珠洗涤三次，并结合蛋白进行洗脱，并通过SDS-PAGE分离。使用抗体对β-连环蛋白进行Western印迹。
荧光素酶报告基因检测 - 将细胞转染TOPFLASH或FOPFlash质粒（Upstate公司）中，用来自亲本Ļ细胞或Wnt3a的表达培养24小时的条件培养基处理。阿β半乳糖苷酶报告基因共转染到正常化转染效率的数据。荧光素酶和β-gal的活动是由荧光素酶和β-gal的测定系统，测定分别按照制造商的说明书（Promega）中。
统计分析 - 所有量化的数据代表了平均一式三份样品。误差棒表示标准差（SD）。统计分析使用Student的t检验，当一个组中，与对照组相比进行。当比较两个以上的组中，使用方差（ANOVA）和Bonferroni多重比较事后检验分析，以确定显着性。 P <0.05为差异有显著。

结果
基于酪氨酸的基序内的LRP6胞质尾用作胞吞作用的信号- 受体介导的内吞作用是通过信号的细胞表面受体的胞内区域内驱动。的LRP6胞质尾包含两个这样的基于酪氨酸的信号：加入|和YXXF序（图1A）。检查他们的LRP6胞吞作用，我们突变既图案从“YRPYSYRHF”到“ARPASARHA”（以下简称为酪氨酸突变体）。此外，由于Wnt信号刺激LRP6磷酸化的PPPS/ TP基序，这对于Axin蛋白结合和它的信号传导活性（临界
10），我们试图研究是否LRP6磷酸化在调节的内吞作用。因此，我们突变的所有五个PPPS/ TP信号基序为Ala（以下简称为丝氨酸/苏氨酸突变体）（图1A）内的关键丝氨酸/苏氨酸残基。
因为变化在给定的细胞群体内不同的LRP6突变体构建体和异源表达中的转染效率可能会导致实验变异性，我们用FLP-在系统建立稳定的HEK293细胞系中的野生型LRP6的单一拷贝（下文称为为WT）或任一突变引入到限定染色质位置。采用实时荧光定量PCR（图1B）和Western blot分析（图1C），HEK293稳定的克隆参展WT或突变LRP6水平相近的被选作研究。
调查特定基序的LRP6胞吞作用，我们首先检查WT和突变体LRP6的通过FACS分析细胞表面的分布。在细胞中表达的LRP6酪氨酸突变体的细胞表面的LRP6的量显著增加的细胞相比，表达的LRP6 WT;然而，在细胞中表达的丝氨酸/苏氨酸的突变体，并没有增加在LRP6的细胞表面水平（图1D）。为了进一步证实该结果，我们进行了细胞表面的生物素化的分析以量化LRP6的细胞表面水平。细胞表面蛋白进行标记与磺-NHS-LC-生物素，隔绝与链霉亲和珠和用抗-LRP6抗体。符合由FACS分析的结果，我们发现，LRP6的细胞表面水平在细胞中表达的LRP6酪氨酸突变体（图1E）中的显著增加。 LRP6的免疫荧光染色也显示，酪氨酸突变体显示出LRP6的增加的细胞表面染色与WT相比，非透化的条件下（图1中，F和G）。在通透条件，LRP6野生主要分布在车厢内体和部分共定位与EEA1，标记为早期内涵体。重要的是，在LRP6酪氨酸突变体在细胞表面的分布相比LRP6 WT则显著上升观察到小的共定位和EEA1（图1H）。总之，这些结果提示，LRP6的基于酪氨酸的基序的中断，但不磷酸化基序，降低其内化并导致增加在其细胞表面上的分布。
为了进一步研究是否LRP6的酪氨酸基序作为一个内吞信号，接下来我们监测的LRP6内吞作用由脉冲追踪分析。细胞表达HA标记的LRP6 WT或酪氨酸突变体首先被孵育的荧光标记的HA抗体在4℃下，该标签LRP6在质膜（图2A）。当升温至37℃，LRP6了大量被内化于细胞表达LRP6与野生后15-30分钟显著内吞作用可见。另一方面，LRP6是即使在60分钟温育细胞表达酪氨酸突变体（图2A）保留大部分在细胞表面。
直接测量LRP6 WT和突变体，125I标记MESD，一个专门伴侣和LRP6的配位体（28,29）的内吞率，被利用来执行的内吞作用测定。内化的配位体的每一个时间点之后的分数进行计算并绘图（图2B）。半时间（t1/ 2）为LRP6 WT和丝氨酸/苏氨酸突变体的内化被确定为4.85±0.73分和5.02±0.42分钟，同时分别LRP6酪氨酸突变体显示出低得多的内吞作用速率与T1 /10.22±0.27分2（图2B）。这些结果进一步表明，基于酪氨酸的基序可能作为内LRP6胞质尾区的内吞作用的信号。此外，我们发现，LRP6酪氨酸突变体显示出更长的半衰期相比，LRP6 WT的时候放线菌酮用于阻断蛋白质合成（图2C）。的t1 / 2为LRP6 WT为3.68小时，并在t1 / 2为酪氨酸突变为7.07小时，这表明LRP6内化的障碍延长其半衰期。
LRP6胞吞突变到胞膜窖的再分配增强其磷酸化和的Wnt/β-catenin信号 - 为了确定抑制细胞内吞作用或磷酸化的LRP6的是否改变了其内在途径中的Wnt3a刺激的存在或不存在下，细胞的溶胞产物表达的LRP6 WT或突变体通过蔗糖密度梯度进行分离。值得注意的是，与LRP6 WT（图3，AC）相比，LRP6酪氨酸突变体显示增加在脂筏LRP6的分布。这些结果表明，通过网格蛋白介导的途径抑制LRP6内化的重新分配LRP6筏馏分。此外，Wnt3a的施用也增加了脂筏级分（图3中，A和B）的LRP6分布。为了进一步验证这一看法，我们分离脂筏相关的膜蛋白从细胞中表达LRP6 WT或突变。符合我们先前的研究结果，我们发现，在没有刺激的Wnt3a（图3，D和E）的脂筏的酪氨酸基序突变增强LRP6分布。调查LRP6磷酸化或内化的干扰是否影响其结合与小窝蛋白，我们研究了它们之间的相互作用中的Wnt3a配体结合的免疫共沉淀分析的存在或不存在。而Wnt3a的刺激显著增加LRP6 WT的关联与小窝蛋白（图3F）中，LRP6酪氨酸突变体甚至在不存在Wnt信号刺激（图3F）显示出更强的关联与小窝蛋白与WT相比。这些结果表明，基于酪氨酸的信号在确定的LRP6内在路线以及用作内吞作用基序具有重要作用。
Wnt/β-catenin信号激活的一个关键步骤，是PPPS/TP序列的磷酸化和LRP6通过酪蛋白激酶1γ（CK1γ）和GSK3β的胞内结构域。 LRP6磷酸化稳定了Wnt/β-catenin信号转换器β-连环蛋白导致信号激活（10）。调查LRP6的网格蛋白介导的内吞作用的破坏是否会影响其磷酸化和Wnt基因/β-catenin信号通路的激活，我们通过免疫印迹分析评估LRP6的野生型和突变体磷酸化状态并且通过TCF通讯分析增强Wnt基因/β-catenin信号。正如预期的那样，在LRP6 野生型和酪氨酸突变体Wnt3a都显著诱导Wnt/β-catenin信号激活，而丝氨酸/苏氨酸突变为未磷酸化并表现出最小的信令激活（图4，AC）。有趣的是，在没有Wnt3a的处理，LRP6酪氨酸突变体以更大的程度磷酸化（图4A），而与WT相比，Wnt信号显示基础水平的减小（图4，D和E）。此外，在细胞中表达的LRP6酪氨酸的突变体用Wnt3a的刺激诱导Wnt/β-连环蛋白更大的活化与野生型（图4，D和E）进行比较。两者合计，这些结果表明LRP6的脂筏分布导致磷酸化的增加;然而，在不存在的Wnt配体时，不足以诱导的Wnt/β-catenin信号激活。
阻断小窝介导的，而不是网格蛋白介导的内吞作用减少LRP6磷酸化和Wnt基因/β-catenin信号 - 要检查LRP6内化路线的改变是否影响其磷酸化和信号转导，细胞表达WT或LRP6突变体用制霉菌素（NYS ）或monodansylcadaverine（MDC）抑制剂处理，抑制因子分别为小窝或网格蛋白介导的内吞作用。我们发现，Wnt3a刺激的存在和不存在NYS都显著抑制LRP6磷酸化，而经由MDC网格蛋白介导的内吞作用的抑制无显著效果（图5A）。我们还研究它的内在途径对Wnt3a的信号激活是重要的。阻断小窝蛋白介导的内吞作用通过NYS抑制Wnt信号传导（图5B）。此外，细胞表达的LRP6酪氨酸突变体显示出更高的Wnt信号传导的激活是通过NYS处理（图5B）抑制。作为LRP6的磷酸化所需的信号激活，我们测试了小窝蛋白-1的由小干扰RNA（siRNA）敲低是否影响LRP6磷酸化（图5C）。与通过NYS处理一致，小窝蛋白1的敲除抑制了LRP6磷酸化（图5，D和E）。有趣的是，抑制经由MDC，或Pitstop2（一个更有选择性的网格蛋白抑制剂）网格蛋白介导的内吞作用，在没有Wnt3a的处理时略微增加了（图5中，F和G）信号的基础水平，而Wnt3a存在时MDC无显著效果（图5F）。总之，这些结果表明LRP6的小窝蛋白介导的内吞作用对Wnt3a诱导的信号传导的活化是是至关重要的。

讨论
Wnt信号/β-catenin信号通路控制着整个的发展和在成年生物现象万千。该途径的异常活化underlies几种人类疾病（30）的发病机制。因此，重要的是要了解的Wnt/β-catenin信号是在生理条件下，以开发对来自该途径的错误调节导致疾病的更好的治疗方法调节。
鉴于Wnt信号级联反应的关键作用，复杂的控制系统已经发展到调节其功能。的Wnt/β-catenin信号是由分泌的配体或拮抗剂结合至LRP6在细胞表面（11）紧紧地调制。除的Wnt配体Dickkopf1（Dkk1的）是该信号传导途径的一个众所周知的强效拮抗剂（
31,32）。以前的研究表明，Dkk1的对LRP6高亲和力和抑制的Wnt/β-连环蛋白通过结合到Kreman（KRM）信令，单跨膜蛋白（33,34）。将所得的Dkk1/ LRP6/ KRM复杂移除LRP6从通过内吞作用的膜，从而衰减的Wnt/β-catenin信号激活（35）。不需要用于触发LRP6胞吞KRM的跨膜和胞质结构域，这表明该功能的胞吞作用的信号可能驻留内的LRP6尾巴。
在目前的研究中，我们发现，LRP6突变体有缺陷基于酪氨酸的图案表现出增加的细胞表面分布，较低的胞吞作用速率和更长的半衰期相比野生型LRP6。此外，内部的LRP6尾基于酪氨酸的基序中断增加了其上的脂筏分布及其与小窝关联。小窝蛋白介导网格蛋白的内吞作用的独立通过细胞膜内陷的脂筏形成小窝（20）。胞膜窖介导的胞吞作用的摄取动力学比的慢得多的网格蛋白介导的（36），这是必要的LRP6降解（37）的通路。这样一来，对LRP6酪氨酸突变的脂筏改变的分布可能它较慢的内吞率的原因和较长的半衰期。安装的研究表明，不同的国际化路线和分子机器被用于两种受体的退化或信号。网格蛋白介导的通路在通过下调跨膜信号受体终止细胞信号传导的关键作用。例如，活化的生长因子诱导的表皮生长因子受体（EGFRs）内化，并通过内体中的低级别的EGF存在下运送到溶酶体中降解，从而防止电池（14,15）的过度生长。另一方面，表皮生长因子受体的受体已显示在脂筏路线被降解并在网格蛋白介导的途径要信令时，EGF的电平为高（16,17）。在TGF-β信号传导的情况下，这两个途径中发挥作用（18），这取决于它的接头蛋白萨拉或RAP2。在这些情况下，网格蛋白途径被认为是直接的受体到回收通路，从而保护受体的降解和支持持续的信令。我们的结果清楚地表明，LRP6受体利用其中小窝依赖性途径促进的Wnt/β-catenin信号转导和网格蛋白途径介导其降解的替代机制。虽然目前还不清楚LRP6到脂筏的易位是否是被动的事件中，基于酪氨酸的基序中的LRP6胞质尾的中断可能会提高其自聚集或联合脂质筏驻留蛋白。我们还发现，LRP6水平的Wnt3a刺激后的脂筏微区均升高。 Wnt3a的处理已经提出来诱导LRP6聚集在质膜和LRP6的聚类提供了一个局部高浓度的受体可能触发LRP6磷酸化CK1γ（9）。这是可能的的Wnt3a诱导LRP6的寡聚化，这增加了它的亲和力脂筏其中LRP6可以被磷酸化和激活。与此相一致的概念，FZ5它与LRP6以激活的Wnt/β-catenin的途径，被内化在一个网格蛋白依赖的方式，当它被表达而不LRP6和Wnt信号，而Wnt3a的-FZ5-LRP6络合物是通过小窝蛋白介导的通路内化响应的Wnt3a（
38）。有趣的是，LRP6酪氨酸突变体显示出更强的磷酸化和信号传导的激活响应的Wnt3a配体和这些效应的小窝抑制剂，制霉菌素被抑制。这些结果表明，小窝用作站点发起配体诱导LRP6的内化。用作信令的平台，这个动态调节可以促进信号转导分子的结合，从而保证了特异性和效率，在信号转导过程（39）。
上有LRP6及其角色的Wnt基因/β-catenin信号通路的激活内在通路冲突的数据。一项研究表明，Wnt3a的诱导通过网格蛋白介导的途径LRP6的内化，导致β-连环蛋白的积累（40）。与此相反，另一项研究表明，通过小窝内化的LRP6的，而不是网格蛋白，是必需的β-连环蛋白的Wnt3a的依赖性积累（38）。此外，已经表明的Wnt3a促进LRP6的胞膜窖介导的内化，而Dkk1的诱导LRP6的内化在一个网格蛋白依赖的方式（37）。最近的研究结果表明，内吞适配器禁用-2（DAB2），其抑制的Wnt/β-catenin信号分路LRP6朝向网格蛋白依赖的内吞途径（41）。虽然进一步的实验是必要的，以确认中的Wnt/β-catenin信号和LRP6胞吞途径的关系，这些事件由量和的Wnt配体和/或衔接分子的存在的亚型容易调节。
以往的研究仅仅通过使用药物抑制和siRNA的方法解决LRP6内吞作用和信号之间的关系可能有潜在的注意事项。这些方法扰乱整个网格蛋白或小窝通路，这可能导致非特异性和/或间接的影响。这可能是不相关的受体或路径依赖这些内在的机制可能会改变，影响LRP6内吞作用和贩卖。使用LRP6内吞作用的突变体，在此我们调查根本LRP6的内吞作用，贩运和信令机制，而不会干扰细胞内吞途径。总之，我们表明，内LRP6尾基于酪氨酸的基序作为一个细胞内吞作用的信号，用于确定LRP6内化途径（图6）。 LRP6是同时涉及网格蛋白和小窝蛋白介导的途径的机制内化。因的Wnt配体与脂筏相关联，因为它们棕榈酰化修饰（42），Wnts的至LRP6和Fz的共同受体的绑定促进其易位到脂筏，其中LRP6可能更容易积累，并形成“signalosomes”（9 ）。聚集的LRP6被磷酸化在这个特殊微区和内化的小窝依赖性，激活的Wnt/β-catenin信号。当LRP6的网格蛋白介导的内吞作用被阻止由于有缺陷的细胞内吞作用的基序，更LRP6被分配到脂筏。该LRP6的脂筏分区的增加导致该受体和的Wnt/β-catenin信号活化的酪氨酸突变体的增强的磷酸化。我们的研究结果揭示了潜在的LRP6内吞作用和信号，以及如何LRP6的网格蛋白和小窝途径之间的动态分配在调节的Wnt/β-catenin信号通路关键作用的分子机制的光。两者合计，了解LRP6的Wnt信号可能有助于开发针对该通路的治疗方法的动态调节和病理作用。