拓扑异构酶I的结构特点及其抑制剂研究进展

发布时间：2011-03-28 23:41:10 来源：文档文库

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引言

DNA拓扑异构酶是存在于细胞核内的一类酶，他们能够催化DNA链的断裂和结合，从而控制DNA的拓扑状态。近来的研究表明，在RNA转录过程中，拓扑异构酶参与了超螺旋结构模板的调节。主要存在两种哺乳动物拓扑异构酶，一类叫拓扑异构酶I，一类叫拓扑异构酶II。拓扑异构酶I催化DNA链的断裂和重新连接，每次只作用于一条链，即催化瞬时的单链的断裂和连接，它们不需要能量辅因子如ATP或NAD。E.coli DNA拓扑异构酶I又称ω蛋白，大白鼠肝DNA拓扑异构酶I又称切刻-封闭酶(nicking-closing enzyme )。拓扑异构酶II能同时断裂并连接双股DNA链．它们通常需要能量辅因子ATP。拓扑异构酶Ⅰ( topoisomerase, Topo)参与DNA复制、转录、重组、修复等所有关键的细胞核内过程,是抗肿瘤研究的重要靶点,以TopoⅠ为靶点的药物在肿瘤化疗中被广泛应用。目前临床使用或处于临床前研究的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂主要分为喜树碱类和非喜树碱类化合物。

1拓扑异构酶I的结构特点（拓扑异构酶I抑制剂研究进展）

1.1 拓扑异构酶I的四个主要结构域

人TopoⅠ为三维晶体结构的单体酶[4],分子量为91ku,共含765个氨基酸,定位于第20号染色体。有限蛋白裂解实验表明,该酶包含4个主要结构域,分别为N端域、核心域、连接子区( linker)和羧基端结构域。其中N端域具有高度正电性,疏水氨基酸很少,不能形成稳定的球形结构域。核心结构域包含了除Tyr723以外的所有活性位点残基。连接子区包含氨基酸636~712,与催化活性无关,但通过Lys650、Arg708与DNA切割位点下游的核苷酸形成氢键,从而对DNA下游有稳定作用,进而减缓再连接过程。羧基端结构域,包含关键活性位点残基Tyr723,与独立的核心结构域(含氨基酸215-635)重组后可以得到接近全酶的活性。突变实验表明,该区还与TopoⅠ的激酶活性有关。

1.2拓扑异构酶I的活性位点

Stewart通过分析人TopoⅠ与DNA复合物的晶体结构,认为TopoⅠ活性位点内的Arg488,Arg590与DNA骨架上磷酸二酯键的一个非桥连氧原子形成氢键,另一个非桥连的氧原子与His632末端Nε2氧原子形成氢键,从而稳定五价配位的催化中间体。然而, Tyr723羟基0.4 nm内没有发现可作为广义碱的侧链原子。最近,切割位点21位为胞嘧啶的TopoⅠ与DNA的非共价复合物Topo70晶体结构测定结果表明,距Tyr723羟基0.23 nm处存在一个水分子,与Arg590的胍基形成较强的氢键作用(距离为0.25 nm),这很可能就是活化Tyr723羟基的特异碱。在该晶体结构中,还发现磷酸基团旋转约75°,使得Lys532可以与一个非桥连氧原子形成氢键。这提示Lys532是继Arg488、Arg590、His632和Tyr723后发现的第5个活性位点功能残基[5]。

2拓扑异构酶I的作用机理

在DNA的复制、转录等过程中,TopoⅠ的酪氨酸残基与DNA的3′末端以磷酸二酯键结合,形成TopoⅠ-DNA可裂解复合物,介导DNA单链断裂,使超螺旋得到松弛,然后再将已断裂的DNA连接起来[1]。肿瘤细胞中TopoⅠ含量及活性远高于正常体细胞,抑制TopoⅠ-DNA可裂解复合物解离,就能选择性抑制肿瘤细胞的快速增殖,进而杀死肿瘤细胞, TopoⅠ由此成为公认的抗癌药作用靶点。TopoⅠ抑制剂并非单纯抑制该酶的催化活性,还可通过与TopoⅠ-DNA可裂解复合物可逆结合,形成抑制剂-TopoⅠ-DNA三元复合物,阻止DNA重新连接,致使复制不能进行下去,从而使细胞死亡。

3拓扑异构酶I的抑制剂

根据目前的研究进展，新的分类方法把TopoⅠ抑制剂分为喜树碱(camptothecin,CPT)类化合物和非喜树碱类化合物。

3.1喜树碱类

具有显著抗肿瘤活性的喜树碱(CPT,1)最早由Wall等人于1966年从珙桐科植物喜树中分离得到。研究表明,在人体内环境中,喜树碱内酯环可通过水解作用断裂而形成开环结构,且开环与闭环两种结构间存在动态平衡。其中,闭环喜树碱可发挥抗肿瘤药效,而开环喜树碱易与人血清蛋白(humanserum albumin,HSA)结合,从而引发严重的毒副作用,同时还会推动平衡向生成更多开环喜树碱的方向移动,因此使闭环喜树碱的浓度降低,影响其抗癌效果。此外,喜树碱还存在水溶性差等问题,使其开发与应用受到一定限制。故研究人员将研究重点放在改善喜树碱理化性质、提高其内酯环稳定性等方

面,近年来已合成了一系列喜树碱衍生物,包括其与大分子多聚物共价结合所得到的喜树碱前药[2],并展开了相应的活性研究,发现在抗肿瘤活性方面,喜树碱类TopoⅠ抑制剂具有如下构效关系。1)若在喜树碱A、B环的7、9、10位引入碱性基团,并与酸成盐后,可使其水溶性增加及生物利用度提高,而引入卤原子、氨基、羟基、烷基和氰基,则可提高其抗癌活性;若7位被大基团取代,化合物活性下降;当10与11位连有亚甲二氧基或亚乙二氧基、或7和9位的取代基连成六七元环、或9和10位相连成环时,均可使化合物抗癌活性改善;当12位有取代时,化合物活性明显降低。

2)E环是喜树碱类化合物结构中最重要的部分,其开环后抗癌活性消失;若将其20位上的羟基替换为卤素、氢或烷基,则抗癌活性下降;当环中的氧原子被氮、硫原子等替换或内酯结构变成酮、醚或胍后,抗癌活性也会消失;而若E环为七元内酯环(其对应化合物称高喜树碱),化合物化学性质则更稳定,抗癌活性提高; 20位羟基与氨基酸等分子成

酯后,内酯环稳定性提高,化合物水溶性增强。现已上市的喜树碱类药物有10-羟基喜树碱(HCPT,2)、拓扑替康(topotecan,TPT,3)、伊立替康( irinotecan, IRT,4)和贝洛替康(belotecan, BLT,CKD602,5),其中伊立替康在体内代谢为活性产物SN-38(6)而发挥抗肿瘤作用。研究发现,拓扑替康与SN-38均为乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和P糖蛋白的底物,部分肿瘤易对其产生耐药性。因此,寻找不易引发肿瘤耐药性的TopoⅠ抑制剂显得尤为迫切。目前,除上述已上市药物外,还有其它喜树碱类化合物处于研发阶段,有望成为抗肿瘤新药,如正处在临床前研究阶段的NSC606985(7)和已进入临床研究阶段的S-CKD602、Gimatecan(ST1481,8)等。

3.2非喜树碱类

3.2.1吲哚并咔唑类

具有抗肿瘤活性的吲哚并咔唑类化合物BE-13793 (14)最早是从链轮丝菌属(Streptoverricillium)发酵液中分离获得的。研究发现,该化合物可作用于TopoⅠ-DNA可裂解复合物,抗癌机制与喜树碱类似。而在其吲哚环氮原子上引入一个吡喃糖后得到的ED-110 (15)对TopoⅠ抑制能力与细胞毒活性都很强,但水溶性差。因此,人们继续对ED-110进行结构改造,得到了具有广谱抗肿瘤活性、且毒性较小的化合物NB-506 (16),目前其已进入Ⅱ期临床研究阶段。此外,进入临床研究阶段的此类化合物还有Edotecarin ( J-107088,17)、Becatecarin (NSC655649,18)和BMS-205749(19

3.2.2 茚并异喹啉酮类

NSC 314622(21)最初是在光花椒碱的合成过程中意外获得的一种茚并异喹啉酮类化合物,后受到美国国立癌症研究所(NCI)的密切关注,该所在分析了NSC 314622对不同来源的60种肿瘤细胞株的抑制活性后,确定其为一种TopoⅠ抑制剂。该化合物在毫摩尔浓度下即可抑制TopoⅠ介导的DNA断裂。