分子生物学结课论文

发布时间：2021-04-28 16:27:35 来源：文档文库

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基因编辑技术的研究进展

摘　要：基因组编辑是成立在基因靶向修饰的基础上，对生物基因组进行改造的一项新技术。通过利用人工核酸酶 ZFn、TALEN 和细菌取得性免疫系统 CRISPR，可在靶位点制造DNA双链切口进而诱导细胞内源性修复机制，通过同源重组修复或非同源结尾连接途径实现基因敲除、替换和纠正。对目前 3 个要紧的基因编辑技术的应用和进展作一综述。

关键词：基因编辑；锌指核酸酶；TALEN；CRISPR/Cas9

Abstract: Genome Editing is built on the basis of gene-targeted modification of the genome of a new bio-technology transformation. Through the use of artificial nucleases ZFn, TALEN and acquired immune systems bacterial CRISPR, can be manufactured at the target point and then induced DNA double-strand incision endogenous repair mechanisms within the cell, connected way to achieve gene knockout by homologous recombination and non-homologous end repair In addition, the replacement and correction. Application and development of the current three major gene editing techniques are reviewed.

Keywords: Gene Editing; Zinc finger nuclease; TALEN; CRISPR / Cas9.

引言：

21世纪以来，科学家一直在寻求加倍精准的方式对特定的基因进行敲除或靶向修饰。20世纪80年代，研究者们能够利用同源重组的方式来对特定的基因进行靶向修饰，但由于自然重组的进程超级罕有，因此，这种方式效率超级低，只能达到10-6。以后的研究发觉，真核细胞的染色体发生双链断裂时，细胞会通过DNA同源重组或非同源结尾连接机制修复双链断裂 [1]，在修复进程中会显现高概率的基因缺失、插入和改变。因此，利用各类方式在染色体上的特定位点进行精准切割诱发DNA损伤修复，使得对真核生物进行精准的基因操作成为可能，以此实现特定细胞组织的遗传操作 [7]。2011年，人工核酸酶介导的基因组编辑技术被 Nature Methods 杂志评选为年度最受关注的技术功效。这3种酶包括有3个要紧的类型 —— 锌指核酸酶 (zinc finger nucleases, ZFn) 、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)，和归巢核酸内切酶 (meganuclease) [5]。本文要紧通过这三种物质来介绍基因编辑技术的进展。

1基因组定点编辑技术的初现——锌指核酸酶 (zinc finger nucleases)

　锌指核酸酶的结构及作用原理

锌指 (zinc finger, ZF) 是一种常见的DNA结合蛋白结构基元，每一个锌指可直接特异识别DNA双螺旋中 3 个持续的核苷酸。人工串联 3~6 个识别不同靶位点序列的重组锌指结构，能够与靶序列特异性结合[1]。将多个锌指串联形成的 ZFP 结构域与IIs 型限制性内切酶 FokI的切割结构域相连接，就可构建成锌指核酸酶 (ZFn)，实现对靶序列的切割。增加串联锌指的数量可识别更长的靶序列,同时也就增加了DNA靶向修饰的特异性[8]。由于FokI需要二聚化来切割DNA，因此，设计好的两个互补的ZFn分子同时与靶位点结合，当两个互补的ZFn分子间相距适当的距离时(6~8 bp)，FokI结构域将二聚化并切割DNA，从而可特异性地在基因组特定位点切断DNA形成“双链断裂缺口”。双链断裂能够启动细胞内的DNA损伤修复机制，一方面细胞通过错配率很高的“非同源重组结尾连接”机制修复双链断裂，从而在ZFn靶位点造成随机性的小片段丢失或是插入，引发基因的靶向敲除；另一方面，由于双链断裂使得同源重组效率大大提高，若是细胞内同时存在与靶位点同源的DNA片段，则细胞要紧通过DNA同源重组的机制修复双链断裂，从而实现靶基因敲除或敲入。

　ZFn的应用

21世纪初期，ZFn技术在基因编辑中慢慢取得普遍的应用。该方式已经在黑腹果蝇、斑马鱼、大鼠、小鼠、拟南芥等模式生物的中成功实现了靶基因的敲除或定点修饰。2005年，Urnov等 [8] 第一次利用ZFn技术对培育的人类细胞进行了基因敲除；2007 年，他们又利用ZFn介导的同源重组对人类细胞进行了基因定点插入；随后，人们接踵在多种类型的人类细胞中，利用ZFn，采纳多种方案实现了多个基因的遗传修饰。ZFn技术介导的基因突变使得一些遗传疾病的医治成为可能。在艾滋病医治方面，Sangamo 公司的 Holmes等尝试利用ZFn技术破坏 CD4+ T 细胞中的内源基因CCR5，能够使 HIV 病毒失去其重要的受体位点之一，从而抑制病毒的繁衍与传播[7]。目前，Sangamo公司针对CCR5设计的ZFn药物已进入三期临床实验时期。可是，ZFn在遗传疾病医治方面的利用还需谨慎，脱靶切割和试剂安全性方面的问题是亟需克服的。

　ZFn的优势和局限

ZFn的显现使得基因打靶效率能够达到30%左右，比被动的同源重组有了质的提升，而且已经能够做到针对某些特定的序列来设计ZFn实现靶基因的修饰，但也有其进展的局限性，ZFn的识别结构域中存在上下文依托效应，使得ZFn设计和挑选效率大大降低，因此目前尚无法实现对任意一段序列都可设计出知足要求的ZFn，也无法实此刻每一个基因或其他功能性染色体区段都能够顺利找到适合的ZFn作用位点，而且在已经成功运用的ZFn的报导中，大多数研究者并非发布其ZF序列[7]。因此，在ZFn的挑选和设计方面还存在较大技术困难，如何构建高特异性的ZFn将成为那个技术以后进展的重点。另外，由于ZFn的脱靶切割会致使细胞毒性，使得其在基因医治领域的应用显现了必然的局限性。目前，只能通过特异性的启动子在必然范围内调控ZFn的表达时刻及表达量以减少脱靶切割，以后如何挑选更适合的启动子或调控方式来降低脱靶切割是ZFn应用中应当克服的一个难题。

2　基因编辑技术的进展——TALEN

　TALEN的结构及作用原理

ZFn的发明使得精准的基因组编辑成为可能，可是由于其对DNA序列识别的不规律性使得自身的进展受到局限。2009年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中发觉一种转录激活子样效应因子——TALE[5]，该因子能特异性地结合DNA。利用该特点，科学家们构建出另一种核酸酶TALEN，用于基因编辑。通过TALE识别特异的DNA序列，FokI 二聚化产生核酸内切酶活性，与ZFn一样在特异的靶DNA序列上产生双链断裂以实现精准的基因编辑。对目前发觉的所有TALE蛋白分析发觉，除第12和13位氨基酸可变外，其他氨基酸都是相同的，这两个可变氨基酸被称为重复序列可变的双氨基酸残基 (repeat variable diresidues,RVD) [9]。TALE特异识别DNA的机制在于每一个重复序列的RVD能够特异识别DNA的 4 种碱基中的1种，目前发觉的5种RVD中，组氨酸 - 天冬氨酸特异识别碱基C；天冬酰胺-异亮氨酸识别碱基 A；天冬酰胺-天冬酰胺识别碱基G或A ；天冬酰胺-甘氨酸识别碱T；天冬酰胺-丝氨酸能够识别A、T、G、C中的任一种。而通过对天然TALE的研究发觉，TALE蛋白框架固定识别碱基T，因此靶序列老是以碱基T开始。因此，理论上能够依如实验目的对DNA结合域的重复序列进行设计，取得特异识别任意靶位点序列的TALE。

　TALEN的应用

TALEN 的发明使基因组编辑的效率和可操作性取得了提高，关于目的片段的切割效率达到了近40%。目前，TALEN 也像ZFn一样，被应用到了不同种的细胞及生物的基因组编辑中。至今为止，研究者们已经应用TALENs 对果蝇、蛔虫、斑马鱼、青蛙、大鼠和猪等模式生物[7]进行了基因组定点编辑[11]。而利用TALEN技术对牛、蟋蟀和家蚕等非模式生物进行内源基因的定点修饰也有报导。在目前的研究中，大多数研究者都利用一对TALENs 对目标基因进行敲除，也有一些报导同时利用了两对TALEN 对同一条染色体上的两个位点进行敲除，使基因组缺失更大的片段。一样的，也已经有研究者利用TALEN 和同源片段的引入实现了在斑马鱼和人的基因组中进行定点插入[10]。在各类遗传疾病的医治方面，TALEN 技术的高精准性使得对这些错误基因的修饰比ZFn更具潜力。Mussolino 等利用TALEN 和ZFn两个技术对人胚肺 293 细胞的 CCR5 及 CCR2 位点中 19 bp的靶序列成功进行了定点敲除，且TALEN 的脱靶切割概率比ZFn要低得多。Sun等利用设计的一对TALEN和同源性序列成功地对缺点型β珠蛋白基因进行了更改，使其恢复到正常序列。

　TALEN的优势和局限

相较ZFn技术，TALEN 利用了TALE分子代替 ZF 作为人工核酸酶的识别结构域，极好地解决了 ZF 关于DNA序列识别特异性低的问题。TALE蛋白与DNA碱基是一一对应的，而且对碱基的识别只由 2 个氨基酸残基决定，这相关于ZFn的设计要简单得多。可是在构建进程中，TALE分子的模块组装和挑选进程比较繁杂，需要大量的测序工作，关于一般实验室的可操作性较低，而商业化公司构建也需要花费上千美元，利用本钱较高；而且，TALEN 的蛋白质相对分子质量要比ZFn大得多，过大的蛋白质分子往往会增加分子操作的难度，去除TALEN 分子的没必要要结构或缩短识别序列的长度能必然程度地减轻阻碍，可是却有可能造成识别特异性降低而致使脱靶切割，引发细胞毒性。

3　基因组编辑技术的新方向——CRISPR/Cas9

　CRISPR/Cas9系统的结构及作用原理

TALEN 关于靶序列识别的精准性使得该技术在近3年来得以飞速进展，可是其构建复杂，而且较大的相对分子质量在某些情形下利用困难也制约了其应用前景。自2002年以来，CRISPR 一直以其独特的结构与特殊的功能吸引着各国科学家们的一起关注。它的结构超级稳固，长度约25~50 bp的重复序列(repeats)被间区序列(spacers)距离。2005年，Cas系统(CRISPR-associated sequences system, CASs) 被发此刻原核生物中表现出某种取得性免疫功能[2]，能使宿主取得抗击噬菌体、质粒等外来DNA入侵的免疫能力。CRISPR/Cas 系统的作用机制大体可分为 3 个不同时期：在噬菌体侵入的起始时期， Cas 蛋白复合物靶向裂解噬菌体基因组中短的原型距离序列，这些原型距离序列整合到宿主基因组中CRISPR 位点的 5′端；然后这些短的掺入的距离序列被转录成 crRNAs ；当宿主再被噬菌体感染时，crRNAs 作为模板通过 Cas 复合物靶向降解噬菌体DNA。CRISPR系统大致分为 3 类，其中 I 型及 III 型CRISPR系统由复杂的Cas复合物介导DNA或RNA的降解，而在产脓链球菌 (Streptococcus pyogenes)中发觉的II型 CRISPR 系统组分较为简单，只需要Cas9和两个非编码RNA，3 个组分即可介导外源DNA片段的靶向降解，因此目前针对CRISPR/Cas9 研究较多。在CRISPR/Cas9 系统中，外源的DNA进入细胞内，细菌的RNaseIII催化crRNA的成熟，成熟的crRNA通过碱基配对与 tracrRNA 结合，形成双链 RNA构[3]。这一 crRNA: tracrRNA 二元复合体指导 Cas9蛋白在 crRNA 引导序列靶标的特定位点剪切双链DNA，在与 crRNA 引导序列互补的位点，Cas9 蛋白的 HNH 核酸酶结构域剪切互补链，而 Cas9 RuvCI 结构域剪切非互补链。

　CRISPR/Cas9系统在基因组编辑中的应用

利用 CRISPR/Cas9 系统对DNA分子的靶向切割特性，使其能够被用于定向的基因修饰。2012年，来自加州大学伯克利分校的 DouDNA研究小组第一利用人工设计的 crRNAs 序列，利用产脓链球菌的CRISPR/Cas9 系统对体外的DNA靶序列进行了精准切割，而且把 crRNA:tracrRNA 二元复合体改造为单链 RNA 嵌合体，也能一样指导 Cas9 蛋白在特定位点剪切双链DNA [4]；以后，又有报导别离证明了通过人为设计能够利用产脓链球菌的CRISPR/Cas9 系统在大肠杆菌细胞对外源噬菌体的双链DNA及外源质粒进行精准地定点切割。2013年初，来自MIT的Zhang Feng 研究小组证明了通过修饰的产脓链球菌 Cas9 蛋白能够在crRNA:tracrRNA 的指导下对 293FT 细胞的特定位点进行精准地切割，他们同时发觉对 Cas9 蛋白的RuvC I结构域进行修改以后， Cas9对目标基因进行单链的切割在人源细胞中一样能够实现。而且，CRISPR/Cas9系统能够通过设计多段 crRNA 来对同一个细胞的多个位点进行切割。来自哈佛的 Church 研究小组同期的实验也利用了CRISPR方式293T、K562 和 iPS细胞进行了精准的基因编辑。以后又有 3 个不同的研究小组也利用了CRISPR/Cas9系统对人、小鼠和斑马鱼细胞一样进行了精准的基因组编辑。CRISPR 对靶位点的切割效率被证明与ZFn和TALEN 相差无几，可是对不同序列的切割效率却存在着不同，只是其脱靶切割的概率相较前两种方式要低的多。总而言之，CRISPR/Cas9 应用于基因组编辑还处于初期时期，但它的确为基因组编辑提供了一个新的思路，在以后的进展中具有极大的潜力。

　CRISPR/Cas9系统的优势和局限

相较于ZFn和TALEN 两种人工核酸酶技术，CRISPR/Cas9系统是一个天然存在的原核生物RNA干扰系统，其介导的基因组编辑是由crRNA指导的，对靶序列的识别是 RNA 与DNA的碱基配对进程，相较蛋白质对DNA序列的识别要精准更多，只要有一个碱基无法配对，就可不能实现 Cas9 对DNA的切割，降低了脱靶切割的概率，减低了细胞毒性。而且，CRISPR/Cas9 系统是由 RNA 介导的DNA切割，若在 RNA水平上进行分子操作，则可实现精准且瞬时的切割，在切割时刻的调剂上相较于ZFn和TALEN 容易患多。可是，CRISPR/Cas9 系统在真核基因组编辑中也存在着一些不足。第一，Cas9蛋白关于目标序列的切割不单单依托 crRNA 序列的匹配，在目标序列 (protospacer) 周围必需存在一些小的前间区序列临近基序 ( protospacer adjacent motifs, PAM)，若是目标序列周围不存在 PAM ( 目前证明 PAM 序列为NGG) 或无法严格配对，则Cas9蛋白不能行使核酸酶的功能，这也造成了利用 CRISPR/Cas9 不能对任意序列进行切割。第二， CRISPR/Cas9 系统所靶向的序列仅需十余个碱基对精准配对，这可能降低 CRISPR/Cas9 系统切割的特异性[6]。而且，作为一个原核的系统，针对真核细胞中染色体的各类修饰结构是不是能够无不同地进行高效切割也需要进一步探讨。最后，和ZFn及TALEN技术一样，CRISPR/Cas9也面临着如何操纵双链断裂以后的非同源结尾连接修复可能随机产生细胞毒性的问题，这在以后的研究和应用中也亟待解决。

4　以后展望

随着愈来愈多不同物种的基因组完成测序 , 解读基因组的功能显得日趋重要。基因组靶向修饰是进行基因组改造与基因功能研究的一个重要手腕。ZFn技术第一为精准的基因打靶打开了大门，可是其关于DNA序列的识别特异性较低，容易造成脱靶切割引发细胞毒性，使得该技术在应用领域的进展受到限制。TALEN 技术利用了转录激活子样效应物 (TALE) 代替了ZF作为DNA识别结构域，原理上能够一一对应不同的碱基而精准识别靶序列，克服了ZFn脱靶切割的问题，使得精准地基因组编辑技术取得一个推动，可是它仍然存在和ZFn一样构建复杂及利用本钱高的问题[11]。利用细菌和古细菌的取得性免疫系统 CRISPR 进行基因打靶是基因组编辑的一个新兴技术，该技术巧妙地利用了原核生物非编码RNA介导的DNA干扰来对目的序列进行精准切割，这种方式具有精准性高、系统构建简单和利用本钱低、能同时对同一细胞多个位点进行切割等优势，可是那个技术的应用目前还处于细胞水平。而且，这一原核系统在面对真核系统复杂的染色体结构时，究竟可否有效切割，此刻还不得而知。目前，以上 3 种方式的应用多是借助DNA的非同源结尾连接，而利用DNA同源重组修复介导序列的插入、置换或修饰的成功案例则较少。在以后的进展中，若是能够提高同源重组的概率以实现高效率的定向基因修饰，则能够在遗传疾病医治和动植物转基因挑选优良品种或构建生物反映器等方面取得应用。总而言之，以上几种基因组编辑技术目前还处于研究的初期时期，但其在基因操作方面已表现出庞大的潜力和广漠的应用前景，将对医学和生物学产生深远的阻碍。

参考文献(References)

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