GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）
和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。
GAPDH分子量为146KD，
beta-actin分子量为42KD,
beta-tubulin分子量可能为100KD
actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。actin大致可分为六种，其 中四种是不同肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余两种广泛分布于各种组织中，包括beta-actin(β-non-muscle)和gamma-non-muscle actin。这些不同的亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中的beta-actin分布就很少， 心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论的。beta-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的， 它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。尽管最近有一些文章已经开始质疑beta-actin作为内参的有效性（好像是对于上样量>20ug的蛋白 区分能力下降，记不清楚了），但是发文章应该还是没有问题的。至于其他的内参也是可以考虑用的，GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，而tubulin和actin类似，是细胞骨架的组成部分，但是不是肌肉的主要成分，应该是一个代替品。
细胞总蛋白的Western Blot 的内参蛋白一般用ACTIN, TUBLIN等细胞内较稳定表达的蛋白。但是核蛋白的Western Blot 内参有LAMIN A, LAMIN B等；膜蛋白的Western Blot一般用α-tubulin或GAPDH为内参。
三种同时发生变化的情况很少，需要具体分析。一旦出现上述三种内参同时发生变化，如果是总蛋白可以用胞核的内参如PCNA，TATA-box bingding protein（TBP）甚至线粒体的内参来代替，当然一般这种可能性出现的几率微乎其微。
Western Blot除了能证明某样品中含有某种蛋白之外，其最为重要的作用是比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少。即为蛋白表达水平最直接的证据。
要衡量蛋白的表达水平，前提条件就是等量的上样量。内参的意义就是保证上样量的一致。
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。如果内参的条带亮度基本一致，那么就可以认为上 样量也基本一致。
在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：
一、 超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。
二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。
三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。
GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。 GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。因为GAPDH 作为看家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参抗体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量 相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。
目的蛋白是在细胞浆的，可以选 a-tubbulin,b-actin 等，如果是细胞核和细胞浆都存在的，可以选y-tubbulin。
bp是碱基对 basepair~
Da是蛋白质分子量范围~
实时定量PCR，用于核酸水平的定量检测。免疫组化用于对目标蛋白进行组织中的位置测定，WB用于检测目标蛋白的量的检测，基本算半定量。
免疫组化
是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和组织学技术（组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等），通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。
elisa（酶联免疫吸附试验）
用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，操作上 开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。
免疫组化和elisa所用到的原理 大致相同，只是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上有所不同。Elisa多用于定量分析，其灵敏度非常高。
western bolt
先要进行SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。
免疫学三大工具，免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。
以下western和Elisa的区别不是原创，是找的资料。
western blotting 可以看到特异性的条带，但是定量比较烦
elisa可以直接读出浓度，但是如果抗体有非特异性结合，那得到的数值就不可信。
WB只能半定量,但是可以检测细胞膜蛋白,这点ELISA做不到
ELISA可用定量方法检测蛋白,也就是说可以观察不同浓度刺激物对目的蛋白的影响
WB所检测的一般是抗原，而Elisa抗原抗体都可以检测。
WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体、降解产物等，一句话，WB可以确定所用抗体是与那种蛋白起作用的；而Elisa无能为力，一锅端了。
WB所适用的一抗一般是线性位点的，ELISA线性或构象型抗体都可以使用。从另一个意义上讲，WB可以做抗体是线性位点还是构象型位点的补充判定，而Elisa不行。
WB一次处理量就是一块胶版，10-20个样品最多了。Elisa一块96孔板一次可以处理96个样本，可以设置多个复孔、对照、梯度样等来提高检测的可信度。
WB操作常见的非特异性条带，膜本底差，显色不好等等缺点在Elisa上表现得要好得多。
Neican
（一）：用内参照是为了评价你的各个上样孔内蛋白的总量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等。这些蛋白在所有细胞中的表达量基本一致，所以用他们来作为你加样量的对照。这样western结果中你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或是人为造成目的条带浓度的变化。严格意义上说，内参事必须做的。
2：常用的内参有：b-actin，GAPDH，近2-3 年，更详细的研究发现，β-Tubulin (球管蛋白)， 被广泛应用于Western Blotting，β－Tubolin分子量为55KD左右。
3：一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参！
（二）要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。
因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小），空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照），已知量标准产物的正对照；另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。
内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。
然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。
在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。
（三）在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：
一、 超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。
二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。
三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。
常用的蛋白质内参有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。我们实验室使用最多的是***工程有限公司与国外实验室合作开发的GAPDH，100μl一支，浓度为100μg/100μl，价格为988元人民币。虽然公司网上称稀释比达1：10000以上，至少可做100次Western mini-blots，但我们一般按照1：5000～6000稀释，不过效果确实非常好，荧光条带非常亮，而且抗体使用3～4次也没太大改变。
我们也使用过博奥森的beta-actin，200ul 480元，稀释比1：200～500。因为稀释比不高，所以价格并不便宜。更可气的是，我PC 12细胞居然有两条条带，小鼠也是两条。
（四）1.所选内参有一下:GAPDH,beta-actin,beta-tubulin等是一些细胞的基本结构蛋白或是管家蛋白,细胞表达稳定,且表达水平高,在同一种类的细胞上表达基本一致.
2.做内参可以:一,检验你的整套western装置是否正常run effectively.包括你的配液,你的胶以及电泳和转移,一抗的效价以及显色等.二检测你的样品蛋白含量是否相等.
3.选择内参要根据你的目的蛋白的性质即你的 目的蛋白是胞内还是核内,你蛋白的 分子量是大是小,当然还有价钱以及你的目的.
4.一般内参是比较容易作出来的,同时它也是帮助你摸索条件的,你把其做漂亮,你后面就很顺利了,只是转移的条件有点变化.其余照样或根据说明书操作.
（五）那么，我想请教一下用过β-actin做内参的朋友，有没有遇到过β-actin抗体检测不到小鼠心肌和肌肉组织β-actin的情况？当然前提是：1，我的确提取到了心肌和肌肉组织的总蛋白，且检测到了我的目的条带。2，用此抗体可以检测到其他组织中β-actin条带。
也发现，在碧云天网站上，曾提及“本抗体不能用于成年动物心肌或骨骼肌的免疫染色”。http://www.beyotime.com/aa128.htm 具体什么原因造成这种情况，我也不想太麻烦去搜了，还请知道的战友指教。同时也算是给朋友们提个醒吧。
另，我曾用GAPDH抗体死活也检测不到小鼠肺组织的条带，由于这个做的时间比较早了，不知道是抗体原因还是我WB的原因还是其他原因，不得而知。仅供朋友们一个参考吧。
回答：我觉得：1 抗原表位有线性（氨基酸序列的不同）和构象型（空间结构的不同）两种，如果你的抗体识别的是构象型的表位，你做western时蛋白要变性，其构想结构破坏，导致抗体抗原不能识别结合，因而也会做不出结果；如果是线性表位则天然的和蛋白变性后这种表位都存在，抗体抗原可以继续结合。你要查询有关资料，排除一下是否是此原因所致。
查了一下actin（肌动蛋白）：“脊椎动物肌动蛋白分为α、β和γ三种类型，α型分布于心肌和横纹肌细胞中，α及γ型分布于平滑肌细胞中，β及γ型分布于非肌细胞中。”
回复：不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响的
所以买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白。
很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题。
就比如我上次买了个抗体，说明书上写着检测的smooth muscle isoform的，因为我的细胞激活后具备的就是平滑肌表型，所以就买了。
买来后一直不出条带，我纳闷了，于是提取大鼠主动脉组织作为对照，也不出条带。火了，就用了另外个细胞株做对照，条带就出来了，而且很亮，压片时能见到荧光，但是我的细胞和大鼠主动脉组织就是没有条带。
后来又做了几次，大鼠主动脉组织也出过两次条带，但是非常细非常淡，若有若无那种，提高上样量也是这样，以致于根本不能扫描，
此公司做抗体是用的是一段合成肽，我比较了两种异构体，只有6，7个AA的差异，
我自己的解释是，这个抗体应该针对的是非平滑肌isoform，但非常小的程度上也能检测到smooth muscle isoform。
目前正在与此公司交涉。
关于是否可以用β-actin 和 GAPDH 做膜蛋白的内参大家也是各持其见
1.不支持的：认为β-actin 和GAPDH是在胞浆中表达的,膜中应该不含有该成分,故不能用来做内部参照,可以用来检测所提的膜蛋白是否纯
2.支持的：他们通过实践行动证实,用β-actin或GAPDH孵育膜可以得到条带
本人倾向于第一种观点，查了些资料，都是说β-actin 和GAPDH是在胞浆中表达的，所以说就算是用上述两种内参孵育出条带也只是说明所提的膜蛋白成分不纯，含有胞浆成分，本人用β-actin孵育过膜，曝光后有相应条带出现，但很淡，但也证实用β-actin做膜蛋白的内参是确实是可以出条带的，但我的理解是膜蛋白成分不纯，含有胞浆成分
我看过两篇外文文献，用的是膜蛋白做WB,一篇是用actin做内参，04年发表在Am J Physiol Cell Physiol 上的。另一篇是用GAPDH，08年发表在 brain research上的，严格来说他不是用来做内参，只是检测膜蛋白成分是否纯
我们提取膜蛋白， 无论是物理方法（密度剃度离心， 双水相）还是化学方法（各种公司的KIT）， 提取的膜蛋白都不可能是完全纯的， 能够达到60-70%都是相当不错的了， 更不要说我们所希望得到的细胞质膜可能还包括了细胞中的亚细胞器的膜， 所以孵育得到条带是完全可能的。
至于质膜的标识蛋白， 也就是NA/K ATP酶（一种整合膜蛋白）， 这个也是没有疑问的（各种integrin也算）至于是否能做内参就看你是不是在变化过程中让这些蛋白与你的体系一同变化了， 如果有， 那就是内参， 如果体系不同， 互相不影响， 那就只能算外参了。
以上内容来自http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=14632303&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0&ticket=ST-5364-wmi9fTqjfYHbCgmOyffWgp6BOfsGTMMzEKM-20
描述有问题。抗体检测的是抗原，所以你检测的是β-Actin
做western很重要的一点就是要有一个参照，比如你要检测淋巴细胞某个蛋白的表达，甚至它的变化（比如对某个细胞因子的反应），这时β-Actin起到几个作用：
1、如果目的蛋白检测不到而且β-Actin也检测不到，那么你的体系有问题，因为β-Actin是看家基因编码的，理论上是100％检测到的；
2、如果目的蛋白检测不到但β-Actin检测到，说明目的蛋白没有表达或者量很低；
3、作为看家基因，β-Actin被认为表达水平不受其它因素影响，是比较稳定的。当细胞接受细胞因子刺激后，目的蛋白的量在参考β-Actin的量后可能发生变化，这时β-Actin还起到一个半定量的作用。
所谓内参就是内部参照的意思。
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Western的抗体通常分为一抗和二抗，一抗结合目的蛋白，这是Western变化最多的地方；二抗则比较通用，商品很成熟，二抗带有荧光或者酶标记，它是结合一抗的，但却是得到结果的重要试剂。这种方法属于间接标记。Western很少有直接标记的方法。
常用的内参有：b-actin，GAPDH，近2-3 年，更详细的研究发现，β-Tubulin (球管蛋白)， 被广泛应用于Western Blotting，β－Tubolin分子量为55KD左右。
本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/92116d30ee06eff9aef807db.html
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