siRNA 和miRNA

发布时间：2011-12-29 12:34:58 来源：文档文库

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siRNA 和miRNA

仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡”？但越来越多的证据清楚的表明，RNA在生命的进程中扮演的角色远比我们早前设想的更为重要。RNA干扰（RNA interference）的发现使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识，更因为可以简化/替代基因敲除而成为研究基因功能的有力工具，因此格外引人注意，在2002年度Science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首。随着对小分子RNA研究的不断深入，研究人员开始认识到：小分子RNA的世界一点都不小。有人推测：小分子RNA可能代表一个新层次上的基因表达调控方式。

小的干涉RNA（small interfering RNA; siRNA）和微小RNA（microRNA；miRNA）是两种序列特异性地转录后基因表达的调节因子，是小RNA的最主要组成部分，它们的相关性密切，既具有相似性，又具有差异性。对小RNA的深入研究将使我们更深一步了解生命的奥秘。本文主要介绍这两种小RNA分子及其作用机理。

siRNA 介绍
RNA 干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，通过这种方式，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉默，迅速阻断基因活性。小的干涉RNA（siRNA）是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA，由约20个碱基对组成，包括5个磷酸盐，2个核苷和3个悬臂。SiRNA在RNA沉默通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。1999年， Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次发现21～25nt 的dsRNA 的出现对转基因导致基因沉默十分重要，而在转基因正确表达的植株中则未出现。随后，Hammond 等进行的细胞提取物核酸酶活性实验证明了小分子RNA在RNAi 中的作用，这些小分子RNA就是由dsRNA形成的siRNA。siRNA 的3?-末端2-nt 的突出对靶点识别的特异性起一定的作用，可将其限定在第一个碱基对相邻的不成对碱基的位置。两个研究小组以数以千计的人类和老鼠基因为目标创建RNAi库的进展，科学进展已清晰地表明：在哺乳动物中利用小的干涉RNA和短发夹RNA（short hairpin RNAs，shRNA）来进行RNA干涉以使基因沉默已经成为强大而有力的生物工具。例如，在基因操作较困难的神经元中，也有成功进行RNAi的报道。Krichevsky等将化学合成的21nt siRNA通过阳离子脂类转染试剂导入原代培养的大鼠神经元，显著抑制内源靶基因和转染基因的表达。抑制神经元NO合成酶表达能有效降低疼痛，在Korneev的实验中设计的双链RNA成功地抑制了中枢神经系统NO合成酶表达，获得RNA干扰的成功。RNAi能在极低浓度（nmol范围）siRNA存在下显示出特殊有效性。

图1 dsRNA可以沉默目标基因。在植物中，通过注入人工合成的RNA病毒或者是插入反向重复序列可以诱导目标基因沉默。在线虫中，沉默也可以用注射dsRNA的方式来诱导。这两种生物体中，沉默是系统的并且传遍全身。a) 沉默信号从脉杆传到叶片组织。绿色是绿色荧光蛋白；红色是叶绿素荧光，可以在绿色荧光蛋白被沉默后看出。b,c）通过实验，使得线虫的核中表达绿色荧光蛋白。实验者在左边加上对照dsRNA，右边加上绿色荧光蛋白的dsRNA。一些神经元核仍然可以检测到荧光，对应于少量的蛋白质表达。c）Hela细胞加上ORC6 siRNA之后，针对微管蛋白（绿色）和DNA（红色）进行染色。ORC6的去除导致多核细胞的积累。稳定的沉默也可以通过表达发夹结构或者折回的双链RNA的表达来实现。d）当和野生型的果蝇相比（右边），成体果蝇中表达控制白色基因的发夹同源物（左边）导致眼睛丧失色素。

miRNA 介绍

miRNA 的研究起始于时序调控小RNA（stRNAs）。1993年，Lee等在秀丽新小杆线虫（Caenorhabditis elegan）中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因lin-4，2002年，Reinhart等又在线虫C.elegan中发现第二个异时性开关基因let-7，2001年10月《science》报道了三个实验室从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似C.elegan的lin-4的小RNA基因，称为microRNA。随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。对一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育进程，造血过程，器官形成，凋亡，细胞增殖，甚至是肿瘤发生(Kim, 2005)。

miRNAs 是一种21－25nt长的单链小分子RNA，其结构特征如下：广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，它本身不具有开放阅读框（ORF）；成熟的miRNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。成熟的miRNA 5’端的磷酸基团和3?端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA独有的特征是其5＇端第一个碱基对U有强烈的倾向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。MiRNAs具有高度的保守性、时序性和组织特异性。miRNAs的表达方式各不相同。线虫和果蝇当中的部分miRNA在各个发育阶段都有表达而且不分组织和细胞特性，而其他的miRNA则表现出更加严谨的时空表达模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）——只有在特定的时间、组织才会表达。细胞特异性或组织特异性是miRNA的表达的主要特点，又如拟南芥中的miR-171仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象；20-24h的果蝇胚胎提取物中可发现miR-12，却找不到miR3-miR6，在成年果蝇中表达的miR-1和let-7也无法在果蝇胚胎中表达，这同时体现了miRNA的又一特点——基因表达时序性。MiRNA表达的时序性和组织特异性提示人们miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。

在科研上，一个小RNA分子要成为miRNA，需要符合以下条件：a）表达需要用Northern-blot来证实；b）小RNA分子必须是处在具发夹结构的前体RNA分子中远离环或膨胀部分的一端才行；c）小RNA分子必须在系统发育上具备相当的保守性。d）前体RNA分子会在Dicer功能下降时积累起来（该项标准由于实践较难，只做参考）。这些标准单独一条不足以证明一个未知小RNA分子是否就是是miRNA，具体地，如果小RNA分子符合上面的a（表达）和b（结构）两条标准；或者a（表达）和c（保守性）；如果表达量很低难以检测，那么如果可以用cDNA克隆的方法得到目标分子，并符合c（保守性）；小RNA分子如果不是通过cDNA克隆的方法得到的，那么就必须符合a（表达）和前体RNA分子结构和保守性的标准才行；如果小RNA分子被推测为miRNA，那么符合c（系统发育保守性）和d（累积性）标准也行；这样我们就可以认为该小RNA分子就是miRNA分子。

寻找miRNA的方法：这里我们简单看一下分子信息学的方法：应用计算机的方法如MirScan来寻找miRNA分子已经在线虫及脊椎动物体内取得了巨大的成功。2004年6月，吳政道在前述的计算机方法的基础上提出一种可以进行高通量筛选miRNA靶位点的方法。用这种方法筛选miRNA的原理：该方法的出发点为前体的发夹状结构及miRNA在物种间的保守性。miRNA基因可能定位于编码蛋白基因的内含子区域（有意义链或反意义链）及远离任何已知基因的基因间区域。一些时候，几个发夹状结构以多顺反子的形式丛集在一起.Uwe Ohler, Chris Burge等人给出了一些可以提高寻找miRNA基因的准确性的一些附加条件：1）上游和下游保守序列的数量；2）候选发夹状结构的上游高度保守的模序的存在。MIT的Bartel and Chris Burge报道了一种可以用来探测miRNA与其作用的靶基因之间的关系的新的计算机的方法——TatgetScan。他们针对已知的每一个miRNA，扫描mRNA的数据库——DNA转译为蛋白的生化信息，搜索与miRNA匹配的片段，然后对miRNA与mRNA的匹配程度评分，推测在三个或以上物种中获得高分的mRNA为该miRNA的靶基因。

RISC 介绍

RNA 诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex; RISC）的组装是在RNAi和miRNA通路中最为复杂的过程。它涉及到小RNA的生产器（Dicer）；小RNA螺旋结构及相应的RLC组装；解螺旋后对称/不对称的RNA螺旋结构及对应的特异性的AGO蛋白质的招募活动。刚产生的siRNAs和miRNAs都是

双链结构，这种双链结构需要解螺旋才能被组装到RISC中发挥作用。组装后的复合物分别称为siRISC和miRISC。通过对链两端的热力学稳定性分析，可以将siRNA分为两大类：对称性siRNAs和非对称性siRNAs。对称性siRNAs有着相同稳定性的末端；从而两条链有着同等结合到RISC中的机会(Schwarz et al., 2003)。与之不同的是，非对称性siRNAs的一端稳定性会比另外一端差些。因为稳定性较差的一端容易解螺旋，因此，偏向性地产生一条链结合到RISC复合物上，这个过程我们称之为“RISCs的非对称性组装(Schwarz et al., 2003; Khvorova et al., 2003)”。不同的AGO蛋白质使得RISCs有着不同的功能，这可能是由AGO蛋白质上PIWI结构域决定的。根据AGO蛋白质的不同，我们将RISCs分成两种：切割型RISC和非切割型RISC。但具体到一个RISC是否切割一个目标mRNA分子，情况就更为复杂些，一般的以下五个方面决定(Tang, 2005)：a）必须是切割型RISC；b）小RNA分子和目标的mRNA的配对情况要达到一定的水平；c）特定生物/组织/细胞中的RISC的切割速率情况（就是说在不同的细胞中是那种形式占据主导地位，是切割还是抑制）；d）小RNA分子的来源背景；e）目标mRNA的特性（数量，更新速率，结构，翻译能力）。

siRNA 的生成及作用机制

dsRNA 引起的RNAi 大致可分为3个阶段即启动、剪切、倍增:
1、启动阶段
研究发现体内dsRNA 除外源性导入外，可能来源于病毒激活、转座子活化及特异重复序列或其他未知途径。研究证实dsRNA 在体内通过21～23 个核苷酸(nt) 片段即小干扰RNA ( siRNA) 发挥其抑制作用。RNase Ⅲ是为数不多的对长dsRNA 显示特异性的核酸酶，依据区域结构可将其分为3 个类型，其中第3 类以果蝇的CG4792 和线虫的K12H4. 8 为代表，

二者在RNA 干扰过程中可以将dsRNA 加工成siRNA，现在称此酶为Dicer 酶。人类Dicer 酶是一个接近普通RNase Ⅲ的蛋白，能够结合并剪切不同的dsRNA。其结构主要包括:N 端螺旋酶区、PAZ区、C 端RNase Ⅲ区(由dsRNA 结合区和串联核酸酶Ⅲ区组成) 以及ATP 结合区和DECH 盒。另外，在其他诸如小鼠等生物中也发现类似的Dicer 酶。Dicer 酶在剪切长dsRNA 为siRNA 过程中起了关键性作用。在线虫及其他生物中发现了lin24 和let27，这是2 个单链RNA 分子，其突变失活可影响发育，被称为stRNA (small temporal RNA) 。二者是特异性蛋白编码基因的负性调节因子，可在翻译水平上调节基因表达。成熟stRNA可与mRNA的3’端非编码区结合而阻遏其翻译，并不引起mRNA 降解。
2、效应阶段
Elbashir等在果蝇体外系统中加入合成21～23nt 的siRNA，使之能有效降解同源mRNA，而当siRNA 浓度增加到一定阈值时，mRNA 降解程度不再继续增加，提示在果蝇裂解液中含有一定数量RNAi 所需蛋白因子。进一步研究得知RNAi 所需蛋白因子是一种复合物，被称为RNA 诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC) 。RISC 是一种核糖核蛋白，包含有RNA 和蛋白成分。其中的RNA 就是siRNA，其蛋白成分包括AGO22、VIG 和dFXR 以及Dmp68 等，实验证实这些成分是RISC 的一部分且为RNAi 所必需。在剪切过程中siRNA 的结构起了重要作用，具有典型结构的siRNA 较平末端siRNA 更能有效引起RNAi 作用，尤其是3′端外悬的第2 个核苷酸影响siRNA 对靶mRNA 的剪切作用。另外，siRNA 对靶mRNA 剪切具有精确的序列特异性。
3、倍增阶段
以往实验发现仅需少量siRNA 即可引起强烈同源基因表达抑制，因此众多学者推测在RNAi 过程中存在倍增放大机制。有人认为在前述的mRNA剪切过程中产生的21～23nt 片段可能会作为新的siRNA 而继续参与RNAi 过程，从而使干扰作用放大。这种扩增机制只是一种推测，是否存在尚需进一步的实验研究确定。RNAi 的系统性作用也是其引起人们关注的重要原因，但机制不明。Spankuch Schmitt 等在乳腺癌细胞系、子宫颈癌细胞系、结肠癌细胞系等细胞中成功进行了RNAi 实验，并观察到癌细胞增殖明显减少、凋亡显著增加。Krichevsky 等用合成的siRNA 导入有丝分裂后期的原代神经元中，有效抑制了其内源性基因表达，使应用RNAi 技术研究神经发育及功能调控成为可能;不久前Song 等在小鼠体内进行RNAi 实验，有效抑制了Fas21 基因表达，从而延长了患自身免疫性肝炎小鼠的生命，为进行RNAi 的动物实验奠定了实验基础。随着RNAi 作用机制的进一步明确、应用技术的完善成熟，RNAi 技术必将为人类研究基因功能，以及对癌症等疾病进行基因治疗提供强大武器。

RNAi 干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。SiRNA并入RISC中，然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对，降解靶标基因，因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。siRNA识别靶序列是有高度特异性的，但这并不是说反义链上所有的碱基都对发挥这种特异性起到了相同的作用。因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生，所以这些中央的碱基位点就显得极为重要，一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应，相对而言，3?末端的核苷酸序列并不要求与靶mRNA完全匹配。

miRNA 的生成及作用机制

与小分子siRNAs相比，尽管两者在分子特性、生物起源等方面是相似的，但也存在不少的差异。siRNAs是由dsDNA在Dicer酶切割下产生，而成熟miRNAs的产生要复杂一些，首先pri-miRNA在核内由一种称为Drosha酶处理后成为大约70nt的带有茎环结构的Precursor miRNAs (pre-miRNAs)(Denli et al., 2004; Gregory et al., 2004; Han et al., 2004)；这些pre-miRNAs在Exportin-5帮助下转运到细胞核外之后再由胞质Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟的miRNAs(Lund et al., 2004; Yi et al., 2003)。两者的作用机制上也存在差别，成熟的miRNAs则是通过与miRNP核蛋白体复合物结合，识别靶mRNA，并与之发生部分互补，从而阻遏靶mRNA的翻译。在动物中，成熟的单链miRNAs与蛋白质复合物miRNP结合，引导这种复合物通过部分互补结合到mRNA的3′UTR（非编码区域），从而阻遏翻译。而在siRNA通路中，单链的siRNA结合到RISC复合物中，引导复合物与mRNA完全互补，通过其自身的解旋酶活性，解开siRNAs，通过反义siRNA链识别目的mRNA片段，通过内切酶活性切割目的片段，接着再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。除此之外，miRNA也可以切割完全互补的mRNA，而siRNA也可以阻遏3′UTR具有短片断互补的mRNA的翻译。

一般来说，一种miRNA它在mRNA上的识别位点有多个，而这种多个识别位点对于miRNA发挥其转录后抑制作用是必要的。3’非编码区也是调控翻译的一个重要组成部分。一个转录本的总体结构由5'非编码区(5'Untranslated Region，5'UTR)，编码区（Open Reading Frame，ORF）和3'非编码区（3' Untranslated Region，3'UTR）组成。现已了解3'UTR具转录本特异性，它在mRNA转录后修饰、细胞内定位及转运、维持mRNA稳定性及保证翻译的效率方面都具重要的调控功能。3'UTR是发生3'末端加工的区域，包含各种顺式(cis-)作用元件，能够和特定的加工复合物互作以调控mRNA的3'末端加工。对哺乳动物的研究表明，真核生物中3'末端加工涉及3'UTR内某个位点的剪切和末端添加多聚腺苷酸尾[Poly(A+)]两个关键过程。应用缺失实验和序列分析已确认了哺乳动物mRNA的3'UTR包含了核心顺式作用元件。这类元件与加工复合物的相互作用是3'末端形成的核心机制，包括三部分：Poly(A+)位点，也可称为剪切位点(cleavage site， CS)，保守序列为YA (Y代表T 或C)的二聚核苷酸，这种保守序列的单碱基比例为A > T > C > G；Poly（A+）位点上游（5'端）10-30 nt 处存在着保守的Poly(A+)定位信号序列(以AATAAA为主)。Poly（A+）位点下游（3'端）存在着稳定3'末端加工复合物作用的保守性稍差的T/GT丰富序列，称为下游作用元件。

miRNA 基因是一类高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分为三种：第一种以线虫lin-4为代表，作用时与靶标基因不完全互补结合，进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性，这种miRNA是目前发现最多的种类。第二种以拟南芥miR-171为代表，作用时与靶标基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常类似，最后切割靶mRNA，这说明某些miRNA和siRNA一样参与了机体内一些特异性mRNA的剪切过程。第三种以let-7为代表，它具有以上两种作用模式，当与靶标基因完全互补结合时，直接靶向切割mRNA，如果蝇和Hela细胞中let-7直接介导RISC分裂切割靶mRNA；当与靶标基因不完全互补结合时，起调节基因基因表达的作用，如线虫中的let-7与靶mRNA3?端非翻译区不完全配对结合后，阻遏调节基因的翻译。

对于miRNAs的研究已经成为目前的一大热点，而种种迹象表明miRNAs可能是一类与肿瘤发生有关的新的基因。像miRNA-15a和miRNA-16a与CLL有关，miRNA-142则与侵袭性的B细胞性白血病有关。研究发现，一些miRNAs能够在肿瘤形成中发挥作用，可以作为肿瘤抑制基因；另外一些miRNAs则是作为癌基因存在。植物miRNA从2002年起才有报道，编码植物miRNAs的基因明显不同于其他生物：植物编码miRNA基因的转录产物可能更大，植物的miRNA与互补结构的错配一般也少于动物，在进化上表现地更为保守。但和动物miRNA一样，miRNA的转录产物也是发夹状结构，在RNaseⅢ酶切割后以双链形式存在，最后释放互补链，miRNA成熟。科学家们已发现miRNA在动植物早期发育中起的关键调节作用，包括植物叶、花的发生，动物胚胎及组织发育等。例如，在carpel factory (car) 突变株中3个miRNAs的表达水平显著下降。CARPEL FACTORY 是一个类似Dicer的酶，参与植物的发育，其缺失突变株表现为胚胎和叶片发育的缺陷。实验结果提示这种缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多数的植物miRNAs在某些特定组织中高水平表达也提示他们可能参与了植物组织的发育过程。Brennecke等人利用电脑寻找靶标基因，证实了miRNA不完全结合3?UTR中存在细胞死亡诱导基因，这提示说明miRNA对生长发育进行更为重要的调控作用。尽管现在研究者们对于miRNAs的认识越来越深刻，仍然有很多的猜想需要证实，比如对miRNAs的潜在的生物学效应的猜测；miRNAs在高级真核生物体内对基因表达的调控作用可能和转录因子一样重要；miRNAs可能代表一个新层次上的基因表达调控模式，等等。所以说，大多数miRNAs的功能仍然是个谜，有待于研究者们更深入的研究。

结束语：

小RNA的研究给我们带来比其本身更为重要的启示是基因组非组蛋白编码区蕴含着重要的生命功能活动信息。生命的一些重要活动如幼虫的生长发育、细胞的发生和分化、神经系统的分化等都被一些非蛋白编码小RNA的调控；而除miRNA、siRNA以外的小RNA我们更是知之甚少。长期以来，分子生物学研究的重点都在蛋白编码基因上，而小RNA的发现和研究则提示我们应该相对更多地从这方面了解生命的奥秘，这些小RNA可能编码生命活动的重要调控元件。有报道称小RNA可影响四膜虫的细胞分裂，如果该种小RNA在人类中存在，则可能与癌症有关，2004年6月《临床研究杂志》上发表的一项实验室研究， siRNA似乎加强了伊马替尼（Imatinib）和雷帕霉素的抗癌作用。而且据说，这种治疗在出现药物耐受性时特别有帮助。SiRNA可以通过与HIV-1细胞内受体CD4，病毒结构蛋白Gag或替代Nef调节蛋白的绿色荧光蛋白的靶mRNA作用抑制病毒产生。SiRNA能有效抑制HIV-1生命周期中整合侵染前后事件。这样，siRNA可能应用到HIV-1和其他病毒侵染的治疗干预中。siRNA技术可能用于抑制HIV-1在宿主细胞中的复制的一种可能的治疗策略。利用小RNA有效抑制基因表达的机理可能为治疗很多病毒性疾病和基因疾病寻找新的途径和突破口。