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环磷酰胺所致卵巢早衰大鼠模型的研究

发布时间：2023-11-26 03:20:44   来源：文档文库   
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环磷酰胺所致卵巢早衰大鼠模型的研究张永芳;马会明;王永峰;李永丽;梁蕾;王燕蓉;裴秀英;徐仙【摘要】目的探讨化疗药物环磷酰胺(CTX致大鼠卵巢早衰(POF模型的血清生殖激素水平、卵巢细胞凋亡和间质损伤等特征.方法以10周龄雌性SD大鼠为研究对象,以50mg·kg-1的首剂量腹腔注射环磷酰胺,再以8mg·kg-1连续腹腔注射14d,建立POF模型.对照组为未注射CTX的雌性SD大鼠.观察并比较两组大鼠体重、血清激素水平、卵巢组织的形态学改变、卵巢间质损伤程度、卵巢颗粒细胞凋亡蛋白定位及半定量表达.结果①模型组大鼠注射CTX后体重低于对照组和注射前(P＜0.05;②模型组大鼠动情周期紊乱,间期持续或延长;与对照组比较,血清E2及AMH下降,FSH和LH升高(P＜0.05;③卵巢间质纤维化,血管标记蛋白CD34染色卵巢血管减少;④模型组大鼠卵巢卵泡颗粒细胞Casepase3、Bax免疫组织化学染色阳性,Bcl-2呈弱阳性;⑤与对照组比较,模型组卵巢组织Caspase-3蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(P＜0.05,Bax蛋白表达两组差异无统计学意义(P＞0.05.结论CTX致大鼠模型的血清生殖激素异常,卵巢间质纤维化,颗粒细胞凋亡,大鼠卵巢功能过早衰竭.【期刊名称】《宁夏医科大学学报》【年(卷,期】2015(037008【总页数】6页(P874-878,前插1【关键词】卵巢早衰;生殖激素;凋亡;环磷酰胺;大鼠【作者】张永芳;马会明;王永峰;李永丽;梁蕾;王燕蓉;裴秀英;徐仙
【作者单位】宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室,银川750004;宁夏医科大学总医院生殖医学中心,银川750004;宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室,银川750004;宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室,银川750004;宁夏医科大学总医院生殖医学中心,银川750004;宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室,银川750004;宁夏医科大学总医院生殖医学中心,银川750004;宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室,银川750004;宁夏医科大学总医院生殖医学中心,银川750004;宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室,银川750004;宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室,银川750004;宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室,银川750004;宁夏医科大学总医院生殖医学中心,银川750004【正文语种】中文【中图分类】R711.6通信作者：徐仙，男，主任医师，教授，硕士究生导师，从事生殖医学研究。E-mail:*************化放疗是临床治疗恶性肿瘤以及防止肿瘤复发的主要方法。环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX是常用的化疗药物之一，具有高度卵巢毒性作用，可作用于细胞DNA而引起DNA单链或双链的断裂，以致DNA、RNA和蛋白质的合成被抑制，使性腺组织永久性损伤[1]。卵巢是CTX雌性生殖毒性作用的主要靶器官
[2]，化疗药物引发的卵巢早衰(prematureovarianfailure，POF占POF总患病人群的25%[3]，一直是医学界的研究热点，但其发生机制和防治方法仍然需要进一步的探索和研究，因而需要建立适宜的化疗损伤动物模型。本研究选择对CTX药物敏感的大鼠为研究对象，建立POF模型检测CTX对大鼠血清激素水平、卵巢血管损伤、间质纤维化及颗粒细胞凋亡蛋白表达等的影响，为临床治疗化疗损伤卵巢疾病奠定实验基础。1.1材料10周龄雌性SD大鼠40只，购自宁夏医科大学实验动物中心(质量合格证编号：0231778。CTX(粉剂，200mg/支，国药准字H32020857购自江苏恒瑞医药股份有限公司，ELISA试剂盒为美国R&D公司生产，兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Casepase3购自美国abcam公司；兔抗B细胞淋巴瘤/白血病-2基因蛋白(Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax、高度糖基化的i型跨膜糖蛋白(CD34抗体、山羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗β-actin抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，蛋白裂解液及SDS-PAGE凝胶试剂盒购自碧云天生物科技公司。1.2实验方法1.2.1POF模型建立40只SD大鼠饲养在23～25℃室内，光照12h，自由饮食。适应性饲养1周后行阴道涂片，选取动情周期正常的SD大鼠称重用于构建模型。选择体重250g的SD大鼠，以首剂量50mg·(kg·d-1CTX/氯化钠溶液腹腔注射，再以8mg·kg-1剂量连续腹腔注射14d，建立POF模型[4]；对照组同等剂量氯化钠溶液腹腔注射，正常饲养15d。
1.2.2取材POF模型组大鼠于最后1d腹腔注射后，晚8：00时禁食不禁水，次日称重，以7%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉成功后将大鼠仰卧位固定于操作台上，常规湿润腹部，开腹，腹主动脉取血4mL，大鼠血液呈高凝状态，4℃放置过夜后以3000r·min-1离心5min，分离血清于-80℃保存，用于检测血清生殖激素。摘取大鼠左右两侧卵巢，一侧4%多聚甲醛固定后常规石蜡包埋、切片，另一侧-80℃保存提取蛋白。对照组的处理同样按照上述步骤进行。1.2.3动情周期检查在CTX注射结束1周后开始连续5d(1次·d-1抓取大鼠行阴道细胞学涂片,经0.2%亚甲蓝染色后光学显微镜下观察,根据阴道细胞形态判断大鼠动情周期。动情前期:椭圆形的有核上皮细胞占绝大多数，白细胞和角质化上皮细胞很少；动情期:片状的，角质化上皮细胞占绝大多数，白细胞和有核上皮细胞很少；动情后期:片状角质化上皮细胞、有核上皮细胞和白细胞3种细胞都有，并且比例无明显异常；动情间期:白细胞占绝大多数，有核上皮和角质化上皮细胞很少[5]。1.2.4血清生殖激素水平的测定ELISA法测定大鼠血清雌二醇(E2、促卵泡激素(FSH、促黄体激素(LH、抗苗勒氏管激素(AMH水平，试剂盒为美国RD公司生产，严格按照试剂盒说明进行操作。1.2.5卵巢组织形态学的观察卵巢组织经过固定、脱水、透明、浸蜡后，常规石蜡包埋，置于LEICA切片机上连续切片，厚度为5μm，苏木精-伊红(HE染色，
苦味酸-酸性品红(VG染色，中性树胶封片后使用奥林巴斯显微镜进行观察并拍照。1.2.6免疫组织化学检测卵巢组织免疫组织化学检测按照文献[6]常规操作，经脱蜡、水化、石蜡切片、抗原热修复、过氧化物酶修复、1%的山羊血清室温封闭30min，分别加入Bcl-2、Casepase3、Bax、CD34一抗(稀释比例1∶150，置湿盒于4℃过夜孵育；次日PBS清洗，加山羊抗兔IgG/HRP聚合物于37℃孵育1h，PBS漂洗，DAB显色，苏木精复染核1min，脱水，中性树胶封片。采用奥林巴斯显微镜进行拍照。对照组卵巢组织处理按照上述步骤进行，不同之处在于采用PBS代替一抗。1.2.7Westernblot法检测蛋白表达模型组和对照组的大鼠卵巢组织用凯基全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，用凯基BCA试剂盒测定其浓度。Western-blot方法按照文献[7]常规操作，12%SDS-PAGE电泳，转PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1h，一抗Bcl-2和Bax(稀释比例1∶300、Casepase3(稀释比例1∶200、内参β-actin(稀释比例1∶1500加至PVDF膜上4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入HRP标记的抗兔二抗(稀释比例1∶10000室温孵育1h，TBST洗膜3次，加ECL化学发光，X光片曝光。使用GraphPadPrism5软件分析其条带灰度值，蛋白相对表达以目的蛋白/β-actin值统计。1.2.8吖啶橙染色模型组和对照组的大鼠卵巢组织石蜡切片经脱蜡、水化处理，PBS清洗，每个切片加0.1%吖啶橙染色1s，PBS清洗3次，加盖玻片封片后荧光显微镜拍照，检测卵巢颗粒细胞是否凋亡。1.3统计学方法应用SPSS17.0软件进行统计学分析，采用独立样本
t检验或单因素方差分析，P≤0.05为差异有统计学意义。2.1大鼠的一般情况比较模型组大鼠在CTX首剂量注射后次日，个别大鼠出现肉眼血尿，后血尿消失，大便性状无明显改变;维持注射CTX后，大鼠进食饮水逐渐减少，活动减少，体重逐渐下降，毛灰暗淡无光泽伴有掉毛；注射CTX后体重低于对照组和注射前(P<0.05，(图1，前插1。2.2大鼠的动情周期比较大鼠的动情周期阴道涂片经亚甲蓝染色后对照组大鼠的动情周期为4～5d，动情间期为1～2d。注射CTX后大鼠的动情周期紊乱，间期延长至4～5d，持续为动情间期(图2，前插1。2.3大鼠血清生殖激素水平比较模型组大鼠血清FSH、LH高于对照组(P<0.05，E2、AMH低于对照组(P<0.01。2.4大鼠卵巢形态学比较2.4.1大鼠卵巢HE及VG染色结果对比对照组卵巢可见各级卵泡,髓质充盈且富含血细胞，黄体数目较多；模型组卵巢可见卵巢皮质增厚、结构混乱,各级卵泡体积较对照组减小,空泡样改变明显,闭锁卵泡增多,间质纤维化(VG染色胶原纤维呈粉红色，粉红色面积越大，纤维化改变越明显,髓质略显充盈(图3，前插1。2.4.2大鼠卵巢吖啶橙(AO染色对比经荧光显微镜观察：502nm激发可见细胞
核AO与DNA结合呈黄绿荧光，460nm激发可见AO与RNA结合胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚，胞质荧光强度减低。模型组较对照组卵巢绿色荧光强度减低(图4，前插1。2.5大鼠卵巢血管标记蛋白CD34免疫组化染色CD34免疫组化可见对照组卵巢血管丰富，阳性染色居多；模型组卵巢血管阳性染色减少(图5，前插1。2.6大鼠卵巢组织Bcl-2、Casepase3和Bax免疫组化染色阳性结果为各级卵泡颗粒细胞呈棕黄色，模型组大鼠卵巢组织中凋亡蛋白Casepase3和Bax卵泡颗粒层细胞着色很深，呈强阳性或阳性；对照组着色均很浅，呈弱阳性或阴性，抗凋亡蛋白Bcl-2阳性染色相反(图6，前插1。2.7Westernblot检测大鼠卵巢的Bcl-2、Casepase3和Bax蛋白表达水平Westernblot检测结果显示：与对照组比较，模型组Caspase-3蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05；模型组与对照组Bax蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05。卵巢早衰(prematureovarianfailure，POF是指女性40岁前由于卵巢内卵泡耗竭或因医源性损伤而发生的卵巢功能衰竭[8]，POF的发病率占育龄妇女的1%~3%。年轻女性因化疗导致卵巢功能过早衰竭是生殖医学界治疗的难题，建立一种合适的动物模型进行研究尤为必要。本研究所选用的SD大鼠生长发育快、繁殖能力强、对CTX反应敏感，且与人类内分泌特征相似度高。实验选择40只大鼠，第1组以首剂量50mg·(kg·d-1CTX/氯化钠溶液腹腔注射，再以8mg·kg-1剂量连续腹腔注射14d；第2组以CTX/氯化钠溶液20mg·(kg·d
-1连续腹腔注射20d。因第2组大鼠不耐受CTX毒性，饮食减少，精神萎靡，活动体重下降极其明显，半数以上死亡，故选用第1组大鼠进行后续试验，对模型组与对照组体重变化进行比较，CTX致使大鼠体重下降，说明建立动物模型成功。卵巢颗粒细胞产生的类固醇激素、FSH、LH等,不仅为卵泡的生长发育提供良好的微环境,促进卵泡的生长,同时也精确的调控着卵泡的生长发育[9]。正常生理条件下，排卵前的雌激素主要由卵泡内膜和颗粒细胞分泌，排卵后的雌激素主要由黄体细胞分泌[10]，促性腺激素释放激素刺激FSH和LH的合成与释放。血清激素主要来源于卵巢颗粒细胞，被视为卵巢储备功能的直接指标，在对卵巢储备的评价中将血清E2与FSH水平结合起来,能够很好地评价卵巢的储备能力功能状态。而血清AMH水平由于不受月经周期影响，近年来，逐渐被公认为判断化疗导致卵巢毒性的最重要的指标之一[11]。临床发现POF患者FSH水平升高，并伴有LH升高，而血清E2水平显著降低，AMH水平低于正常水平[12]。本研究显示，使用CTX后大鼠卵巢受到化疗药物的损害，化疗时处于发育阶段的卵泡的颗粒细胞被大量杀伤，其分泌E2和AMH的水平下降，引起FSH和LH升高，模型的内分泌特征与临床所见POF内分泌特征符合。性成熟后雌性大鼠生殖器官发生增生、退化的周期性变化，即动情周期，一般为4～5d，可分为四阶段:动情前期(0.5～1.5d、动情期(1～3d、动情后期(1～3d和动情间期(1.5～2.5d。动情期雌激素分泌达高峰，而动情间期雌激素分泌最低，这与人类女性月经周期相似。对于正常排卵的雌性大鼠个体，整个动情周期中
AMH保持在恒定的水平，不随性腺激素的波动而变化。动情周期中阴道脱落细胞形态结构的变化主要是受性周期中雌激素变化的影响,因此阴道涂片法可以较准确地区分大鼠性周期的每个阶段。注射CTX后大鼠的动情周期紊乱，间期延长提示卵巢分泌雌激素的降低。女性卵巢对化疗毒性非常敏感,化疗药物对女性患者的卵巢具有细胞毒性作用影响卵泡的生长和成熟过程的同时,引起卵泡的破坏和卵巢的纤维化,导致POF。研究发现,化疗严重影响卵巢结构及细胞增殖，使卵泡过早排空，导致卵巢原始卵泡减少。本研究显示CTX引起卵巢卵泡内颗粒细胞不同程度损伤，卵巢微环境改变而出现卵巢功能的过早衰竭。卵巢HE和VG染色可见模型组卵巢皮质增厚和间质纤维化程度加重、结构混乱,各级卵泡体积较对照组减小,空泡样改变明显,闭锁卵泡增多,间质纤维化,髓质略显充盈且显示新生血管内皮细胞的CD34阳性细胞明显少于对照组，说明本实验所实验的给药方法及剂量能够造成卵泡发育微环境的损伤，产生有效的卵巢损伤效果。细胞凋亡是化疗药物引起卵巢结构及功能破坏的重要机制,凋亡最先出现在颗粒细胞中[13]。吖啶橙与双链或单链DNA形成绿色荧光复合物，CTX作用于细胞DNA而引起DNA双链或单链的断裂，引起细胞凋亡，故模型大鼠卵巢AO染色发现模型组较对照组卵巢绿色荧光强度减低。CD34属于钙黏蛋白家族，在卵巢血管内皮细胞有棕黄色染色。抗凋亡蛋白Bcl-2抑制细胞凋亡，而Bax是一个凋亡促进基因,Bax过度表达时细胞凋亡增多。哺乳动物中,Bcl-2和Bax调节下游的Caspase-3途径诱导细胞凋亡。Caspase-3是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶,是细胞凋亡的执行者，直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统,一旦被激活,凋亡不可避免,最终可通过酶解灭活凋亡抑制物、酶解细胞外基质及骨架蛋白、裂解DNA修复相关分子等机制促进细胞凋亡,因此Caspase-3也被称为“死亡蛋白酶”
[14]。CTX致POF模型组大鼠卵巢组织中凋亡蛋白Casepase3和Bax卵泡颗粒层细胞着色很深，呈强阳性或阳性；对照组着色均很浅，呈弱阳性或阴性，抗凋亡蛋白Bcl-2阳性染色相反;正常大鼠卵巢中Caspase-3不表达，大鼠卵巢环境缺乏促性腺激素而诱导凋亡的时Caspase-3有表达，提示CTX除直接损伤DNA外，引起的细胞凋亡也参与了大鼠的卵巢损伤。至于对生育能力的确切影响尚需延长观察时间。CTX引起大鼠卵巢颗粒细胞凋亡，卵巢间质损伤、纤维化，引起卵巢功能过早衰竭。因此，选取并构建合适的动物模型进行化疗性卵巢早衰的研究，有很重要的临床意义。[1]VermaS,GoldammerT,AitkenR.CloningandexpressionofactivationinducedcytidinedeaminasefromBostaurus[J].VetImmunolImmunopathol，2010,134(3-4:151-159．[2]MatsudaF,InoueN,ManabeN,etal.Folliculargrowthandatresiainmammalianovaries:regulationbysurvivalanddeathofgranulosacells[J].ReprodDev，2012,58(1:44-50.[3]XuejingZ,YanhongH,YuechengY,etal.GnRHantagonistcetrorelixinhibitsmitochondria-dependentapoptosistriggeredbychemotherapyingranulosacellsofrats[J].GynecolOncol，2010,118(1:69-75.[4]成杰,丁利军,胡娅莉.卵巢早衰动物模型制备研究进展[J].中国比较医学杂志,2013,04:66-70.[5]施新猷.现代医学实验动物学[M].北京：人民军医出版社，1999:331.[6]GeP,XingN,RenY,etal.PreventiveEffectofamericanginsengagainstprematureovarianfailureinaRatModel[J].DrugDevResDrug
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本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/7fa30379e618964bcf84b9d528ea81c758f52e24.html

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