03纤维素酶检测方法

广东溢多利

生物科技股份有限公司

纤维素酶

酶活力的测定方法

编号：VTR-J-07-3-C/0-05

颁发部门：品管部

技 术 标 准(国标）

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1. 目的

建立纤维素酶活力的测定方法，为各部门人员测定纤维素酶活力提供依据

2. 适用范围

适用于饲料添加剂的饲料酶产品，也适用于添加有纤维酶的浓缩饲料和添加剂预混合饲料。

3. 方法原理

纤维素酶从纤维素中分解出还原糖，还原糖又同2—羟基—3.5—二硝基苯甲酸发生反应，产生一种黄—橙混合色，可用分光光度法测定其色深。

4. 定义

在规定条件下，每小时催化底物生成1μmol葡萄糖的酶量定义为一个酶活力单位（μmol／hr）。

5. 试剂和溶液

5.1 磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液

溶液A：0.2 mol/L Na2HP04·H20：取Na2HP04·H20 35.6g或Na2HP04·12H20 71.62g，用蒸馏水溶解后定容至1000mL。

溶液B：0.1 mol/L柠檬酸液：取一水柠檬酸（C6H8O7·H20）21.01g，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL。

溶液C：取A液493 mL，加入507 mL B液混合均匀即为pH4.8磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液。

5.2 DNS试剂

取酒石酸钾钠182g，溶于500mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3.5－二硝基水杨酸6.3g，NaOH 2lg，苯酚5g，亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用，室温下放置7天后使用。有效期一个半月。

5.3 羧甲基纤维素钠（CMCNa）溶液

取2g羧甲基纤维素钠（粘度300—600厘泊）溶于 200mL蒸馏水中，水浴加热至溶，用一层纱布过滤。取滤液 100mL，加入 PH=4.8 磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液 20mL，蒸馏水 40mL混匀，贮冰箱备用。一周后应重新配制。

5.4 1%标准葡萄糖液〕

精确称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖（AR）1.000g，以蒸馏水溶解，定容于100 mL容量瓶中制成1%浓度的标准葡萄糖液

6. 仪器和设备

6.1 恒温水浴锅 40±2℃

6.2 紫外分光光度计UV1601

6.3 电子天平(0.001g)

6.4 漩涡混合器

7. 试验步骤

批准

日期

审核

日期

编制

日期

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酶活力的测定方法

编号：VTR-J-07-3-C/0-05

颁发部门：品管部

技 术 标 准

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7.1 标准曲线的制作

分别吸取1%标准葡萄糖液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL于50 mL容量瓶中，用蒸馏水制成每mL分别含有葡萄糖200，400，600，800，1000，1200μg的标准液。各取不同浓度标准液0.5 mL于试管中，加PH4.8磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液1.5 mL，DNS试剂3 mL于沸水浴中沸腾7min（样品放入重新沸腾时算起），取出后立即加入蒸馏水10 mL混匀，冷却后，在紫外分光光度计550nm比色，以所得的光密度OD值为横座标，以对应的标准葡萄糖液浓度的二分之一的值（即：100，200，300，400，500，600，此为每管中葡萄糖的μg数）为纵座标，绘制标准曲线。

空白的制作：以0.5 mL蒸馏水代替0.5 mL标准葡萄糖液，以下操作步骤同标准曲线制作

7.2 测定步骤

待测酶液的制备，精确称取一定量“四分法”采样取得的样品1.000g至50mL的试管中，加缓冲液19mL置于漩涡混合器中震荡至完全溶解，于40℃土2℃的水浴锅浸提60分钟，浸提过程中反复震荡3－4次，浸提后取上清液作为待测酶液。

待测酶液用缓冲液稀释到一定倍数（控制测定OD值在0.2—0.4之间），取经40℃预热的此稀释液0.5毫升，加入经40℃预热的CMC液1.5mL（每个样品同时作2 －3个不同稀释倍数的梯度，每个梯度同时作两支平行试管）， 40℃恒温精确反应20分钟，立即加入DNS试剂3mL，立即沸水浴中煮沸7分钟，终止反应，以下步骤同标准曲线制作。

空白制作：取稀释液0.5mL后，先加入DNS试剂3mL，再加入CMC液1.5mL，以下步骤同样品操作。

8. 计算

r 60

CMC酶活力（μmol／hr·g或u／g）＝—————×———　

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　w·20　　　180　

式中：r　—从曲线上查得与标准葡萄糖液相对应葡萄糖微克数。

60　— 1小时＝60分钟。

　　　　　　　1

W—实际参与反应的酶量即0.5×—————

稀释倍数

（注：稀释倍数为从固体酶粉到最终稀释酶液过程中，每次稀释倍数之积。）

20—反应时间，min

180—为葡萄糖的分子量。

注：每个样品同时做的两支平行试管，其相对误差＝±l0％，超过此范围，试验应重做。

批准

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审核

日期

编制

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