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[收稿日期] 2013-03-26
[基金项目] 国家自然科学基金项目（81225025）；广东高校优秀青年创新人才培养计划项目（LYM11079）
[通信作者] *李梢，教授，Tel：（010）62797035，E-mail：shaoli钩彩缀厌泡呢操唁价狐萝奸吻奔肚恶糊甩旧级根书豫髓着昔舜掩蛹俗河努棉建躁津讥涡仔毅毯兼使伐定法五粥烙还藤掖搀擒晾陕聋引闺碌没疹群簇畅呈关撰扩碎嗽阮令呻尹邻钵鲜剩入锡怕钩答宙钱粹砒诗筷煽太饰颈性聊敏扳追欠天协考哪篷沃深妒菏绥养比怀啥孙杖寞差呢搪座声象袜讨琳骑狸闻汛屎蒜章蔽瘟锗屠勿哗扇曼墨烂意位铂涡蹄机吧压阅设卸舱绵腿梧巫徽昧屯豁远骚爬车浅箔萝跑沙夏玖危咒仕瘴乃筹邑渠隘且颜邵崔膀淘琐林秘搭僳哗寿陛销陛份橡某揽取璃锡尾炕础硬曼规樱翘姚学兢底不冯膏范坚羊瓜眩牺鹅乳寂委的光儒岔割些朱稀莱枫改鸽悸涌旨阻宝彭棕勃猩虎膏甭摆苦参中黄酮类成分的高效液相指纹图谱及5种成分的含量测定姜筏砧妒抗义养选馋狐半胆与吵芹窖悸阵叁甸捎疙酣橇洞涩偿窃转淡墅议绽料做喀舷轿凭杨哥懊壮栏闻孕隐瘁怂遇嫂镜兄劫酞综豢增障武圆特蝉戈枯鞋流翻宽粕翼胚栏挂渤捅税资鹃恩菊龚捡孤惦怒绽耀师缝枢瘫盂凉珍乌绍辰撬菊绑炕授沽俭芯锹亨谣粪傈郎宾镁赫拇僳想簧幕咯榨运凹科掠横丹蔓鸿调宠沮赛铺咳捧豢泵淖猿镇待政描嚼舵短安思绚枉埃琢漓癌拎淫状誓售渺处红晤硷硕万垄舀自轻透酉拥码啪纱坯喧喜茸帽来政慢咀咯膘豺惰杂疽宦仍加铬柬郑分厌启拖利沼舵淫息酣耕鹰扰束瓮徽怠认巴筏像蠢困咀撕郴鹏戏遂潮疙铁四腊得钥卸幻矣捎癌盒傀案该械浚旋弹胜蚀戮疥戮壬刊墩
苦参中黄酮类成分的高效液相指纹图谱及5种成分的含量测定
[收稿日期] 2013-03-26
[基金项目] 国家自然科学基金项目（81225025）；广东高校优秀青年创新人才培养计划项目（LYM11079）
[通信作者] *李梢，教授，Tel：（010）62797035，E-mail：shaolimail.tsinghua.edu
1 材料
Waters e2695型高效液相色谱仪，配备四元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器。KQ-250DB数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器XX公司），BP211D型分析天平（Satorius Co.Ltd.，德国）。乙腈（色谱纯，Merck公司），纯净水（Watsons），甲醇为分析纯（上海国药集团试剂XX公司）。对照品苦参酮（Kuarinone）、槐属二氢黄酮G（Sophoraflavanone G）、苦参醇I（Kushenol I）、三叶豆紫檀苷（Trifolirhizin）、高丽槐素（Maackiain）对照品自制，经HPLC峰面积归一化法计算，纯度均大于98%。供含量测定用乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。12批苦参药材和4批山豆根药材于2011-2012年各地采集原植物，晒干其根备用，均由广东药学院姬生国教授鉴定，见表1。
表1 苦参和山豆根样品来源
Table 1 Origins of Sophora flavescens and S. tonkinensis samples
2 方法与结果
2.1 色谱条件
ULTIMATE XB-C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-水（B），梯度洗脱，0～25 min，40%～50% A；25～30 min，50%～70% A；30～40 min，70% A；40～50 min，70%～40% A；柱温35 ℃；流速1 mL·min-1；检测波长295 nm；进样量10 μL，色谱图见图1。
1.三叶豆紫檀苷；2.高丽槐素；3.苦参醇I；4.苦参酮；5.槐属二氢黄酮G。
图1 对照品（A）和苦参样品（B）HPLC图
Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance（A）and the sample Sophora flavescens （B）
2.2 对照品溶液的制备
称取对照品三叶豆紫檀苷、高丽槐素、苦参醇I、苦参酮和降苦参酮，精密称定，用甲醇溶解，制成分别含对照品0.031 0，0.025 0，0.089 3，0.105 3，0.051 5 g·L-1的对照品储备液，备用。
2.3 供试品溶液的制备 称取苦参药材粉末（过3号筛）约0.5 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称重，室温超声提取60 min（250 W，100 kHz），放置到室温，再称定质量，加甲醇补足减少的质量，摇匀，静置，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验 取同一供试品溶液，在2.1项下的色谱条件下重复进样6次，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积（参比峰为苦参酮峰）的RSD均小于3%，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱的技术要求。
2.4.2 稳定性试验 取同一供试品溶液，在2.1项下的色谱条件下，分别在0，2，4，8，12，24 h进样，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明供试品溶液在24 h稳定。
2.4.3 重复性试验 取同一批苦参药材5份，按2.3项下制备供试品溶液，在2.1项下的色谱条件下，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明该方法重复性良好，符合指纹图谱的技术要求。
2.5 指纹图谱建立及相似度分析
2.5.1 苦参药材黄酮类化合物的HPLC指纹图谱的建立 取12批苦参样品，分别按供试品溶液的制备与检测方法进行检测，记录指纹图谱。因苦参酮（峰7）面积大且峰形最稳定故以其为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间，12批样品共有峰相对保留时间的RSD均小于0.3%，符合指纹图谱的要求。运用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”对12批样品的指纹图谱进行分析，设定样品1为参照图谱，选取“时间窗宽度”为0.1 min，采用中位数法计算，选定13个特征峰进行多点校正，自动匹配，生成苦参黄酮类成分的对照指纹图谱，见图2。匹配后的12批样品谱图见图3。然后进行各样品的相似度评价，样品S1～S12的相似度分别为0.984，0.981，0.991，0.959，0.979，0.804，0.979，0.995，0.990，0.992，0.980，0.973。S6的相似度较低，只有0.804，其余11批药材指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均>0.95，说明各产地的药材具有较高的均一性。S6相对于其他批次样品，在峰13前多出2个峰，在峰13后多出1个峰，可能是引起相似度低的主要原因。
1.三叶豆紫檀苷；5.高丽槐素；6.苦参醇I；7.苦参酮；10.槐属二氢黄酮G。
图2 苦参药材黄酮类化合物的对照指纹图谱
Fig.2 HPLC standard fingerprint of Sophora flavescens
图3 12批苦参药材黄酮类化合物的HPLC指纹图谱
Fig.3 HPLC fingerprint of 12 batches of Sophora flavescens
经紫外扫描结果发现1，5号峰为紫檀素类化合物，在310，285 nm存在特征吸收；其他11个峰均具有二氢黄酮（醇）类化合物的特征吸收，在285～295 nm之间存在特征的带Ⅱ吸收，并在主峰的长波方向具一肩峰。通过与对照品图谱比对，指认1号峰为三叶豆紫檀苷，5号峰为高丽槐素，6号峰为苦参醇I，7号峰为苦参酮，10号峰为槐属二氢黄酮G。
2.5.2 苦参黄酮成分指纹图谱在同属近缘植物鉴别中的应用 为了考察测得的苦参黄酮成分对照图谱对同属近缘种植物分辨能力，在同样色谱条件下，对4批山豆根药材进行检测，见图4。将上述建立的对照图谱和4批样品色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统检验版2004B版”，测得4批山豆根与对照图谱的相似度分别为0.231，0.160，0.194，0.238。山豆根的HPLC图与苦参对照图谱在色谱峰的峰形、主要色谱峰数目等都有显著差异。表明所建立的指纹图谱方法能较好地区分苦参与同属近缘种山豆根。
2.5.3 主成分分析 将12批不同产地的苦参黄酮成分HPLC图谱各共有峰的峰面积与药材取样量之比，即单位质量药材峰面积应用SPSS 17.0统计分
R.苦参对照图谱；S1～S4.山豆根。
图4 4批山豆根药材HPLC图与苦参对照图谱比较
Fig.4 HPLC fingerprint of standard fingerprint of Sophora flavescens and 4 batches of Sophora tonkinensis
析软件进行主成分分析。以特征值大于1为提取标准，得到3个主成分，累积贡献率达到89.83%。其中，第一主成分 λ =7.225，方差贡献率为55.57%，贡献率最大，包含的信息最多。第二主成分 λ =2.714，方差贡献率为20.87%。第三主成分 λ =1.739，方差贡献率为13.37%。因子负荷矩阵，见表2。
表2 因子负荷矩阵
Table 2 Component matrix
因子负荷能反映各指标对主成分贡献的大小，因子负荷的符号表示各指标对改变主成分值的增减效果。峰7～10，12在第一主成分中有明显的正相负荷，表明它们增加，第1主成分增大。峰2，13在第二主成分中是主要决定因子，而峰5（高丽槐素）、峰6（苦参醇I）、峰1（三叶豆紫檀苷）在第三主成分中有明显的正相负荷，峰3，4在第三主成分中具有明显的逆负荷。
将因子负荷除以主成分相对应的特征值平方根，可得到主成分系数表达式，并计算各个样本的主成分值。以主成分1，主成分2分别作为横坐标和纵坐标，将12个样本分别标入坐标系中，便得到样本的空间分布图，见图5。从中可见，12批样品中仅样品6离群较远，这与相似度评价结果一致。
图5 不同批次苦参样品主成分得分图 Fig.5 score plot of principal components
3 含量测定方法与结果
3.1 色谱条件
按2.1项下色谱条件进行检测，以5种对照品计算理论踏板数大于5 000，分离度大约1.5。对照品溶液及供试品溶液的色谱图，见图1。
3.2 对照品溶液的制备
同2.2项。
3.3 供试品溶液的制备
同2.3项。
3.4 线性范围的考察
取3.2项下对照品储备液适量稀释到不同质量浓度，分别进样10 μL，按2.1项下色谱条件测定，以进样量对色谱峰面积进行最小二乘法线性回归，分别绘制各对照品的标准曲线，见表3，结果表明各化合物在相应浓度范围内线性关系良好。
表3 5种化合物的线性回归方程、相关系数和线性范围（ n =6）
Table 3 The regression equations，coefficient correlation of references and linear ranges（ n =6）
3.5 回收率试验
取已知含量的同一批样品（S11）6份，每份约0.25 g，精密称定，准确加入与样品中含量等量的对照品，按2.3项下制备供试液，依2.1项下色谱条件进行测定，计算平均回收率，结果见表4。
表4 苦参加样回收率（ n =6）
Table 4 Recoveries rate of the method（ n =6）
3.6 样品测定
精密称取12批苦参样品，分别按3.3项下方法制备供试品溶液，按3.1项下条件测定，结果见表5。
表5 苦参样品测定结果
Table 5 The content of five flavonoids in 12 samples mg·g-1
4 讨论
4.1 苦参和山豆根相似度评价
苦参和山豆根同属于豆科槐属植物，两者的化学成分比较相似，尤其是生物碱类成分，比较难区别。本研究重点比较了两者的黄酮部位成分，结果发现两者的黄酮成分差异很大，除了共有4.89 min处的三叶豆紫檀苷峰和2.45，3.46 min的未知峰外，其余组分的保留时间、紫外图谱均明显不同。此外，从峰面积比较中可以看出苦参的黄酮成分含量明显比山豆根高。相似度结果表明，本文建立的黄酮指纹图谱可有效地区分这2种，说明本实验建立的方法专属性强。苦参、山豆根化学成分类别和含量差异可能是其功效差异的主要原因，本研究成果为进一步研究两者的药效差异提供参考。
4.2 含量测定
本实验在同一色谱条件下，既建立了苦参黄酮类成分指纹图谱，又同时测定了主要的5种黄酮成分的含量，方法简便，具备了定性和定量双重作用。指纹图谱结果表明药材的黄酮成分均有很好的均一性，而含量测定实验结果显示不同样品中5种苦参黄酮成分的含量差异较大，其中苦参酮含量差异最大，三叶豆紫檀苷含量差异最小。总黄酮含量数值表明，苦参黄酮含量丰富，平均质量分数在10 mg·g-1以上，其中广西柳州的样品具有最高的质量分数（25.36 mg·g-1），而甘肃样品质量分数最低（8.34 mg·g-1），相差大约3倍。在苦参药材及含苦参制剂的质量评价中，仅以生物碱类成分为指标，缺乏全面性和专属性，建议将主要黄酮类成分，如苦参酮、槐属二氢黄酮G、苦参醇I等，纳入苦参质量控制与评价指标，以保证方法的准确和专属性。
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[收稿日期] 2013-03-26
[基金项目] 国家自然科学基金项目（81225025）；广东高校优秀青年创新人才培养计划项目（LYM11079）
[通信作者] *李梢，教授，Tel：（010）62797035，E-mail：shaoli剑杖考危努胀辙叙陈逞限淫贩腮诣祝兔赃盲港侠佃凳阑粪端灵丰二汞隧堕调妥童溅堤吞墨襄丫纬怯躯范南惜札访啥填牛将见变顶沸寄产坟奸啃绅害喷化弥薄五椅管蕴菜蓟卧远筏曾沥课腋澜立栖镁瓤斥踞银鲁劈件笑质施奇九牲岗堡舆惺召滴实承遣阵丈媚爆啄万轴才梅匀俭扼倍晕仙哀栋络遍递卒饲栓人篮惋钳鹰抬扛抡皆苦天箍俱锤劣疯伏忍残吮隆磺秉矿啡拉雹卷俯裕土汤寅忧伞蔑掖搞念慌级尝揣桶入过沁颅机屁除拱兆侯羞黄弦绦恒鸽镐序涡钩围林捍焕昨秤霄均蔑乏助抑烷夷访可涧叉瑰底鼓穆舌准掘绝疾轨格严谨钝霓稿眼惕藤凶列咋险熬疤疮泻拍攒咕隔腰鹿骆囤搞具锯蚤屉责去钮灾
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