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正在进行安全检测...

发布时间：2023-11-27 17:23:37   来源：文档文库   
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高碘促成纤维细胞增殖作用与成纤维细胞生长因子及其受体的关系华浅近;祖茂衡;滕飞;王磊;胡琳【摘要】目的研究高碘促进成纤维细胞增殖作用与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF、成纤维细胞生长因子2型受体(FGFR2的关系,探索.高碘因素在布-加综合征(BCS隔膜组织形成过程中的作用机制.方法①将体外培养的成纤维细胞分成对照组、溶媒组、KI组、FGFR抑制剂组和KI与FGFR抑制剂共同作用组,采用CCK-8法检测各组成纤维细胞增殖率.②采用免疫印迹法检测不同碘浓度(0、250、500、1000、2000、3000μg/L培养环境中bFGF、FGFR2蛋白表达量.多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA,多个实验组与1个对照组比较采用最小显著差法(LSD.结果①在1000μg/L碘浓度组,KI与FGFR抑制剂共同作用组成纤维细胞增殖率(1.06±0.13高于FGFR抑制剂组(0.40±0.12,而低于KI组(1.73±0.09,组问差异有统计学意义(P＜0.05.②在500、1000μg/L碘浓度组,FGFR2蛋白相对表达量高于其他碘浓度组,而1000μg/L组高于500tμg/L组,组间差异有统计学意义(P＜0.05.各碘浓度组间bFGF蛋白相对表达量差异无统计学意义(P＞0.05.结论①高碘冈素可能通过上调FGFR2蛋白表达量而引起成纤维细胞增殖;②高碘导致的成纤维细胞增殖可能与隔膜形成相关.【期刊名称】《介入放射学杂志》【年(卷,期】2013(022012【总页数】5页(P1016-1020【关键词】布-加综合征;碘;成纤维细胞;隔膜;实验研究
【作者】华浅近;祖茂衡;滕飞;王磊;胡琳【作者单位】221000徐州医学院附属医院介入科;221000徐州医学院附属医院介入科;221000徐州医学院附属医院介入科;221000徐州医学院附属医院介入科;221000徐州医学院附属医院介入科【正文语种】中文【中图分类】R543.5我国布加-综合征（Budd-Chiarisyndrome，BCS）以下腔静脉和（或）肝静脉开口处隔膜阻塞型为主，其特征是下腔静脉和（或）肝静脉开口处隔膜形成，而隔膜的形成机制至今尚未明确［1］。病理学研究发现成纤维细胞为该隔膜主要构成成分之一，隔膜组织中成纤维细胞生长因子受体（fibroblastgrowthfactorreceptor，FGFR）的表达明显高于正常血管壁组织［2］。此外，国内流行病学研究发现BCS的发病率与饮用水中碘含量呈正相关［3］，同时一定浓度的高碘培养环境能促进成纤维细胞、血管内皮细胞增殖［4-5］。本研究以CCK-8检测法［6］检测FGFR抑制剂SU5402与适宜浓度碘离子共同作用下成纤维细胞的增殖情况，应用免疫印迹法检测不同浓度碘离子培养环境中成纤维细胞的碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）、FGFR2蛋白表达的情况，探讨高碘促成纤维细胞增殖作用与bFGF、FGFR2的关系及与下腔静脉隔膜形成的相关性。1材料与方法1.1细胞株培养HFL1人肺成纤维细胞（目录号GNHu28）购自中国科学院上海生命科学研究院
细胞资源中心。细胞培养于Corning培养皿中，采用F12K培养基（Sigma公司），加10%胎牛血清（Gibco公司）。于37℃、5%CO2条件的培养箱中静置培养，至细胞贴壁生长汇合即可传代，每周传代2次，选取第5～6代细胞用于实验。1.2细胞增殖检测取对数生长期的成纤维细胞，胰酶消化后制成细胞悬液，用细胞计数板作细胞计数，测定细胞密度，再用培养基稀释至5×104个/ml。将细胞悬液接种至96孔板中，每孔约5000个细胞，分为5组：①空白对照组（每孔100μl细胞悬液，20μlF12K培养基）；②溶媒组（每孔100μl细胞悬液，19μlF12K培养基，1μlDMSO）；③KI组（每孔100μl细胞悬液，15μlF12K培养基，5μlKI）；④SU5402组（每孔100μl细胞悬液，15μlF12K培养基，5μlSU5402）；⑤SU5402和KI共同作用组（每孔100μl细胞悬液，10μlF12K培养基，5μlSU5402，5μlKI）。以上各组均设6个复孔，其中③、⑤组的碘终浓度为1000μg/L，④、⑤组的SU5402终浓度为100μmol/L。随后于37℃、5%CO2条件的培养箱中静置培养16h，更换新的F12K培养基，每孔再加入CCK-8工作液（日本同仁）10μl，孵育40min。以F12K培养基加CCK-8工作液孔作为本底调零，于450nmol/L波长处测定各孔吸光度（A）值，间接反映细胞数量，各组A值去除1个最高值和1个最低值。以上实验重复3次。1.3bFGF、FGFR2蛋白表达取对数生长期成纤维细胞1∶6传代，培养48h后换液，设空白对照组和碘离子组。空白对照组直接用F12K培养基培养。碘离子组：在F12K培养基中分别加入碘化钾，使碘离子终浓度分别为250、500、1000、2000和3000μg/L，再将细胞置于培养箱中孵育12h。采用Western印迹法检测bFGF、FGFR2蛋白表达。用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA
法测蛋白浓度、SDS-PAGE电泳、转膜和免疫反应。bFGF、FGFR2一抗（Abcam公司）均以1∶500稀释，二抗稀释比均为1∶1000。显色方法为5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/氯化硝基四氮唑蓝（BCIP/NBT）发色显色法。以上条带均以β-actin作为内参照。扫描后采用IPP6.0图像分析软件对特异性条带进行半定量分析，以bFGF/β-acting，FGFR2/βacting的灰度值比值评定bFGF及FGFR2的蛋白表达水平。以上实验重复3次。1.4统计学分析采用SPSS16.0软件进行统计学分析。检测结果以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），多个实验组与1个对照组比较采用最小显著差法（LSD），以P＜0.05为差异有统计学意义。2结果2.1FGFR抑制剂对成纤维细胞增殖的影响空白对照组（1.06±0.13）与溶媒组（1.02±0.11）间细胞增殖率差异无统计学意义（P＞0.05）。KI组（1.73±0.09）细胞增殖率明显高于对照组，SU5402组（0.40±0.12）细胞增殖率明显低于对照组，SU5402和KI共同作用组（1.18±0.10）细胞增殖率高于对照组，但低于KI组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。2.2不同碘浓度对bFGF、FGFR2蛋白表达的影响各碘浓度组与空白对照组比较，bFGF蛋白相对表达量差无统计学意义（P＞0.05）。500和1000μg/L碘浓度组FGFR2蛋白相对表达量较空白对照组明显提高，且1000μg/L组明显高于500μg/L组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1～3。表1不同浓度碘环境中bFGF、FGFR2蛋白相对表达量与空白对照组比较aP＜0.05组别标本数蛋白相对表达量bFGFFGFR2空白对照组34.438±0.071
0.596±0.022碘浓度（μg/L）25034.549±0.0320.573±0.02750034.546±0.0520.902±0.024a100034.421±0.1031.071±0.050a200034.441±0.0450.568±0.037300034.531±0.0810.615±0.017图1bFGF、FGFR2蛋白在各组中的表达注：泳道1为空白对照组；泳道2～6分别为碘浓度250、500、1000、2000和3000μg/L组图2不同碘浓度对bFGF蛋白相对表达量的影响图3不同碘浓度对FGFR蛋白相对表达量的影响3讨论3.1高碘促成纤维细胞增殖的作用途径国内流行病学调查显示，隔膜型BCS患者分布地区的饮用水中碘含量超过正常标准，并且BCS患者尿碘高于正常人，同时一定浓度的碘能促进成纤维细胞增殖［5］。bFGF是FGF家族中最具代表性的成员，它作为重要的促有丝分裂原对成纤维细胞有明显的促增殖作用，能趋化血管内膜的各类细胞并促进其增殖和迁移，在损伤修复过程促进细胞胶原酶的产生从而加速胶原分解，并通过促进基底膜纤维的重新排布使基质层纤维有序排布，达到减少瘢痕形成的作用［7］。FGFR是一类穿膜的酪氨酸激酶受体，介导FGF信号传递入细胞，分1～6个亚型，其中FGFR1、2为bFGF高亲和力受体。FGF/FGFR途径在细胞增殖和分化、创伤愈合和肿瘤细胞的分裂增殖中起重要作用［8］。本研究用的SU5402是2-［（1-2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-3-亚基）甲基］-4-甲基-1H-吡咯-3-丙酸，能靶向作用于FGFRl激酶结构域铰链区的ATP结合位点，由于FGFR之间的结构和序列相似，可通过与ATP结合而抑制FGFR2的磷酸化，从而也抑制FGFR2的活性［9-10］。本文结果显示，KI组细胞增殖率明显高于对照组，与刘小琴等［5］发现的碘离子浓度≤3000μg/L具有促进成纤维细胞增殖和抑制细胞凋亡作用的结果相符。而对于高碘促进成纤维细胞增殖的机制少见报
道。腾飞等［11］在体外以高碘环境培养血管内皮细胞，发现碘离子促进血管内皮细胞增殖并非通过提高血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）及其受体（VEGFR）的蛋白表达量实现，同时发现高碘能刺激血管内皮细胞膜受体VEGFR-2（Tyr1214）磷酸化水平上调而介导血管内皮细胞迁移。血管内皮细胞和成纤维细胞均为BCS隔膜的主要成分，高碘培养环境能引起两者的增殖，本研究以高碘对BCS隔膜另一主要成分的成纤维细胞增殖机制为切入点进行研究，结果显示SU5402组细胞增殖率明显低于对照组，表明成纤维细胞增殖依赖于FGFR1和（或）FGFR2作用。SU5402联合KI共同作用组细胞增殖率低于KI组，但仍高于对照组，表明高碘对成纤维细胞的促增殖作用不仅通过对FGF/FGFR途径刺激实现，还通过其他途径实现，具体机制有待进一步研究。3.2高碘与bFGF、FGFR2蛋白表达的关系及意义FGFR2是bFGF的高亲和力受体，在bFGF促进细胞增殖和迁移过程中起至关重要的作用［7］。FGFR2与多种肿瘤的发生发展密切相关，而被认为是肿瘤治疗的重要靶点，但其在血管内隔膜形成过程中的作用尚少见报道。本研究的Western印迹结果显示，碘浓度500和1000μg/L组的FGFR2蛋白表达明显提高，且1000μg/L组明显高于500μg/L组，提示高碘离子能促进成纤维细胞FGFR2蛋白表达且呈浓度相关性。碘离子对成纤维细胞的增殖和凋亡具有双向效应，较低浓度的碘离子对成纤维细胞增殖起明显的促进作用，随着碘离子浓度的升高促进作用逐渐消失，碘离子浓度较高时成纤维细胞增殖活性受到抑制，高碘对成纤维细胞的作用呈现出剂量-效应关系［5］，本研究发现碘浓度2000和3000μg/L组的FGFR2蛋白表达低于500和1000μg/L组，与空白对照组无明显差异，说明高碘对成纤维细胞FGFR2蛋白表达的影响也存在剂量-效应关系。bFGF通过与其低亲和力受体硫酸肝素蛋白多糖（HSPG）结合，再通过HSPG结合到FGFR上。研究表明，2个FGFR2蛋白分子与1个HSPG分子结合，FGFR2
的Y657位点发生二聚化，并发生自磷酸化而活化形成稳定的二聚体［12］。FGFR2活化后可磷酸化成纤维细胞生长因子受体底物2（FRS2）［13］，募集生长因子受体结合蛋白2（GRB2），而后激活蛋白激酶C（proteinkirmseC，PKC）、Ras/Raf/MEK/ERK等信号转导途径，通过细胞信号转导通路的活化而参与调控细胞增殖、分化等生物学功能。FGFR2蛋白表达量的提高将强化上述作用过程，导致包括成纤维细胞在内的多种细胞增殖条件发生紊乱，刺激细胞内的多种信号转导通路［14］。因此，高碘可能通过上调FGFR2蛋白表达量对成纤维细胞产生促增殖作用，而具体作用机制和激活的信号转导通路还需深入研究。各碘浓度组成纤维细胞bFGF蛋白表达量无明显差异，提示高碘促成纤维细胞增殖作用并非通过提高bFGF蛋白表达量实现，高碘对HSPG、FRS2、GRB2蛋白表达及对bFGF降解胶原作用是否有影响还需进一步证实。3.3高碘与BCS隔膜组织形成的相关性目前研究发现，我国隔膜型BCS病例的地理分布和水源性高碘地区分布基本相符，并且患者尿碘水平明显高于正常人［3］，这些研究均证实了BCS患者体内外的高碘环境。近年发现高碘能刺激BCS隔膜主要成分之一的内皮细胞膜受体VEGFR-2（Tyr1214）磷酸化水平上调而介导肌动蛋白重塑、张力纤维形成及VEC迁移。本研究发现，高碘因素可提高FGFR2蛋白表达量并促进其增殖，这与BCS隔膜组织检测到增殖的成纤维细胞、高表达的FGFR结果相一致。我们推测由于肝静脉开口处的血流切应力、膈肌损伤等因素引起了肝静脉开口处血管壁损伤［15］，暴露出内皮下层的血管内皮细胞、成纤维细胞，而患者血液中高碘因素引起损伤处血管内皮细胞、成纤维细胞增殖及血管内皮细胞向管腔内迁移，促进BCS隔膜的形成。然而，不同类型BCS的发病机制不同，本研究主要针对隔膜阻塞型BCS的隔膜形成机制，而不能解释以肝静脉血栓、闭塞、狭窄形成为特点的单纯肝静脉病变型
BCS发病机制，单纯肝静脉病变型BCS发病机制的研究主要针对血栓形成原因，如JAK2-V617F基因突变、凝血因子Ⅴ基因G1691A突变、红细胞增多症等［1］。此外，在体外高碘环境单一培养成纤维细胞无法模拟出动态变化的人体血液内环境及隔膜的多种细胞及组织成分，本研究发现了高碘能上调FGFR2蛋白表达量，但具体作用机制和所激活的下游信号转导通路还需深入研究。［参考文献］［1］ChengD，XuH，LuZJ，etal.ClinicalfeaturesandetiologyofBudd-ChiarisyndromeinChinesepatients：asingle-centerstudy［J］.JGastroenterolHepatol，2013，28：1061-1067.［2］白卫星，李天晓，翟水亭，等.布-加综合征隔膜组织病理学与相关因素研究［J］.介入放射学杂志，2008，17：463-467.［3］肖培瑞，蔺新英，郭成浩，等.布-加综合征分布与饮用水碘含量关系研究［J］.环境与健康杂志，2010，27：618-620.［4］王晓磊，徐丽雅，张海涛，等.不同碘浓度对培养血管内皮细胞增殖的影响［J］.山东大学学报：医学版，2007，45：310-312.［5］刘小琴，郭成浩，张海涛，等.碘对成纤维细胞细胞周期及凋亡的影响［J］.环境与健康杂志，2010，27：568-570.［6］王涛，李冰晴，王津津，等.CCK-8检测法研究槲皮素对人Tenon囊成纤维细胞的抑制作用［J］.眼科新进展，2007，27：576-580.［7］FengDF，WangCY，WangH，etal.bFGF-inducedhumanperiodontalligamentfibroblastsproliferationthrought-typevoltage-dependentCalciumchannels［J］.ActaOdontolScand，2013，71：9-14.［8］伊海英，孙晓艳，付小兵，等.碱性成纤维细胞生长因子的研究进展［J］.解放军医学杂志，2008，33：776-778.
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本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/6c694a6374232f60ddccda38376baf1ffc4fe362.html

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