菌种鉴定的几方面特征

菌种鉴定的几方面特征

1、个体形态：镜检细胞形状、大小、排列，革兰氏染色反应，运动性，鞭毛位置、数目，芽孢有无、形状和部位，荚膜，细胞内含物；放线菌和真菌的菌丝结构，孢子丝、孢子囊或孢子穗的形状和结构，孢子的形状、大小、颜色及表面特征等。2、培养特征：①在固体培养基平板上的菌落和斜面上的菌苔性状（形状、光泽、透明度、颜色、质地等）。②在半固体培养基中穿刺接种培养的生长情况。③在液体培养基中混浊程度，液面有无菌膜、菌环，管底有无絮状沉淀，培养液颜色等。3、生理生化特征：生理生化特征与微生物的酶和调节蛋白的本质和活性直接相关，酶及蛋白质都是基因产物，所以对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较，加上测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多，因此生理生化特征对于微生物的系统分类仍然是有意义的。4、血清学试验与噬菌体分型。5、氨基酸顺序和蛋白质分析。6、核酸的碱基组成【(G+C)%】7、核酸的分子杂交。

营养缺陷型的应用

从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始菌株，称为野生型菌株。野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养（氨基酸、维生素、核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长，称为营养缺陷型。营养缺陷型菌株的筛选，在生产实践和基础理论中都有着重要的意义。生产实践中，营养缺陷型可用于工业微生物育种，协助解除代谢反馈调控机制，从而达到大量积累终产物的目的；也可将营养缺陷型菌株作为生产菌种杂交、重组育种时的遗传标记。在基础理论中，营养缺陷型不仅被广泛应用于阐明微生物代谢途径上，而且在遗传学上具有特殊的地位。在遗传规律中的转化、转导、原生质体融合、质粒和转座因子等的研究中，营养缺陷型是最常用的标记菌种。

代谢调控的类型

1、初级代谢的调节控制：虽然代谢调节方式很多，由于微生物细胞体内的所有生化反应都是在酶的催化下进行的，因此，对酶的调节控制是最主要、最有效的调控方式。它包括两个方面，一是调节酶的合成量（反馈阻遏），二是调节现成酶分子的催化活力（反馈抑制）。两者密切配合和协调，以达到最佳的调节效果。①酶合成的调节：酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速度的调节机制，这是一种在基因水平上（在原核生物中主要在转录水平上）的代谢调节。凡能促进酶生物合成的调节，称为诱导，而能阻碍酶生物合成的调节，则称为阻遏。②酶活性的调节：酶活性调节是以酶分子的结构为基础的，在酶分子水平上的一种代谢调节。它是通过改变现成的酶分子活性来调节新陈代谢的速率，包括酶活性的激活和抑制两个方面。2、次级代谢的调节控制：①次级代谢产物的诱导调节②次级代谢产物碳源分解调节③次级代谢产物氮源分解调节④次级代谢反馈调节⑤磷酸盐调节⑥细胞膜透性的调节

原生质体的制备方法

制备大量具有活性的原生质体是微生物原生质体融合育种的前提。为制备原生质体，必须有效地除去细胞壁。去壁的方法有三种：⑴机械法⑵非酶分离法⑶酶法。采用前两种方法制备的原生质体效果差，活性低。酶法分离原生质体的方法：首先选择原始亲株，经过遗传标记筛选，得到直接亲本，采用培养皿平板玻璃纸或摇瓶振荡法培养，取年轻的菌体转入到高渗溶液中，加入有关水解酶，在一定条件下（温度、pH值等）酶解细胞壁。酶解后释放的原生质体和残存菌丝片断的混合液经过滤，除去大部分菌丝碎片。滤液进一步低速离心10min，洗涤后弃去上清液，沉淀悬浮于同一种高渗溶液中，即可得到纯化的原生质体。

融合体的鉴定

融合体中除重组体外，还有异核体或部分结合子、杂合二倍体或杂合系，这些都会在平板上形成菌落，检出融合体的方法有多种，在育种工作中可根据实验目的和微生物不同加以选择，下面是在原生质体融合育种中经常采用的。⑴利用营养缺陷型标记选择融合体，其检出设计的原则是在分离的培养基上只有融合体生长而不能让双亲本原生质体形成菌落。融合的双亲带有不同营养缺陷型标记，原生质体融合处理后的混合物直接分离到基本培养基上就可检出融合体。⑵利用抗药性选择融合体，微生物的抗药性是菌种的重要特性，是由遗传物质决定的。不同种的微生物对某一种药物的抗性存在差异，利用这种特性也可用于融合体筛选。⑶利用荧光染色法选择融合体，荧光染色法是事先使双亲染色体而携带不同荧光色素标记，然后在显微操作器和荧光显微镜下，挑取同时带有双亲原生质体荧光标记的融合体，直接分离到再生培养基上再生，最后得到融合体。⑷钝化选择法，用灭活原生质体和具活性原生质体融合（营养缺陷型），由于灭活亲株原生质体和营养缺陷型亲株原生质体在基本培养基上都不能生长，只有融合体才能形成菌落。

菌种选育的方法和特点

1、诱变育种：微生物的诱变育种，是以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的突变株，并且找出发挥这个变株最佳培养基和培养条件，使其在最适的环境条件下合成有效产物。基因突变是微生物变异的主要源泉。人工诱变又是加速基因突变的重要手段。以人工诱发突变为基础的微生物诱变育种，具有速度快、收效大、方法简单等优点，它是菌种选育的一个重要途径。2、杂交育种：微生物杂交的本质是基因重组，优点：第一，通过具有不同遗传性状菌株的杂交，使遗传物质进行交换和重新组合，改变亲株的遗传物质基础，扩大变异范围，使两亲株的优良性状集中于重组体内，获得新品种。第二，通过杂交后获得具有新遗传特性的重组体，不仅可克服因长期诱变造成的生活力下降，代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降低对诱变剂的“疲劳”效应。第三，通过杂交可以总结遗传物质的转移和传递规律，丰富并促进遗传学理论的发展。3、基因工程育种：与传统育种方法不同的是，基因工程育种不但可以完全突破物种间的障碍，实现真正意义上的远缘杂交。而且这种远缘既可跨越微生物之间的种属障碍，还可实现动物、植物、微生物之间的杂交。广义的基因工程育种包括所有利用DNA重组技术将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得前者的某些优良性状或者利用后者作为表达场所来生产目的产物。由于微生物是单细胞，且结构简单，是基因工程理想的表达载体。所以许许多多来自于不同界的物种（人体、动物、植物、微生物等）的基因都被成功地克隆到微生物细胞中并获得表达。

诱变育种的方法和优缺点

诱变育种具有方法简单、投资少、收获大等优点，但它最大缺点是缺乏定向性。在诱变育种过程中应注意出发菌株、诱变剂及诱变剂量的选择、诱变处理方式方法的应用，以及结合有效的筛选方法等来弥补不足，以提高诱变育种的效率。诱变育种的步骤和方法包括：出发菌株的选择，单孢子（或单细胞）菌悬液的制备，诱变剂及诱变剂量的选择，诱变的处理方法，以及纯化分离等。1.出发菌株要求：⑴对诱变因素敏感的菌株；⑵选择具备一定生产能力，并且在生产过程中经过自然选育的菌株；⑶采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早而多的菌株；⑷选择纯种作出发菌株；⑸选择出发菌株应考虑其稳定性；⑹选择出发菌株的其他因素；2.出发菌株的纯化：确定诱变出发菌株之后，就要进行纯化，通过菌种纯化分离，从单菌落中挑选所需要的优良菌株，与具有其他性状的菌株分离开来，从中获得遗传性状基本一致的，并且稳定的变种。纯种分离方法，常用划线分离法和稀释分离法。 3.单孢子（或单细胞）悬液的制备：在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、均匀的悬液状态。这是因为，一方面分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，另一方面又可避免长出不纯菌落。4.诱变剂及诱变剂量：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质，称为诱变剂。它们包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂三大类。诱变的最适剂量，应该使所希望得到的突变株在存活群体中占有最大的比例，这样可以减少以后的筛选工作量。5.诱变的处理方法：⑴单因子处理⑵复合因子处理①两个以上因子同时处理②不同诱变剂交替处理③同一种诱变剂连续重复使用④紫外线光复活交替处理。

反馈阻遏和反馈抑制的原理

反馈阻遏：主要是通过终产物与阻遏蛋白的亲和力的改变，使阻遏蛋白与操纵基因结合，不能合成mRNA，从而达到对整个反应过程进行调节的目的。反馈抑制：主要的作用方式在于末端产物对反应途径中调节酶的抑制。受反馈抑制的调节酶一般都是变构酶，酶活力调控的实质就是变构酶的变构调节。变构酶分子具有两个和低分子物质结合位点，一个是与底物结合的催化中心（活性中心），另一个可与调节因子（又称效应物）相结合的调节中心（变构中心）。当效应物与调节中心结合后，可引起酶蛋白分子发生构象变化，从而引起酶的活性中心对底物的亲和力和催化能力的改变，阻碍了酶和它的底物的结合，促进或抑制了酶活力，使整个代谢途径的快、慢受到调节，称这种现象为变构效应。

抗反馈调节菌株的筛选

抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。其特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产，如果由于结构基因突变而使变构酶成为不能和代谢终产物相结合的，便是失去了反馈抑制的突变，称为“抗反馈突变型”，若是由于调节基因突变引起调节蛋白不能和代谢终产物相结合而失去阻遏作用的，称为“抗阻遏突变型”。操纵基因突变也能造成抗阻遏作用，产生类似于组成型突变的现象。其方法是把结构类似物作为筛选的遗传标记。通常是把结构类似物和培养基混合制成平板，诱变后菌体分离其上，经培养，那些被解除反馈调节的突变株可以选择性地生长，并在细胞内合成相应的氨基酸。变株的菌落在生长过程把氨基酸分泌到培养基中，促使菌落周围敏感菌的生长，形成一个混淆的增殖圈，挑取增殖圈大而明显的菌落，进一步试验复证。

建库前的菌种的检定（大肠杆菌表达的工程菌菌种）

1、划种LB琼脂平板，应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长，2、涂片革兰氏染色，在光学显微镜下观察为典型的革兰氏阴性杆菌，3、对抗生素的抗性，应与原始菌种相符，大多数为抗氨卡青霉素，4、电镜检查，应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。5、生化反应，应符合大肠杆菌生物学性状，6目的产物表达量，在摇床中培养应不低于原始菌种的表达量，7、表达产物的类型，用免疫学或合适方法证明型别无误，8、质粒检查，质粒的酶切图谱应与原始质粒相符。

微生物细胞的破碎方法

化学法：1、自溶法，细胞膜结构在一定的条件下，由于细胞自体的各种水解酶如蛋白酶、酯酶等的酶解作用而发生溶解，2、表面活性剂处理法，常用十二烷基硫酸钠等阴离子表面活性剂，3、脂溶性溶剂处理法：用丙酮、氯仿、甲苯等溶解细胞的脂蛋白，4、用低渗溶液，如氨水、稀盐及含有少量有机溶剂的水溶液处理，是细胞膜胀破。物理法：1机械磨碎法，2、加压破碎法，在55Mpa的高压下，急速喷射撞击挤压。3超声破碎法，4反复冻融法。生物学的方法主要是采用酶解法

生物产品浓缩和干燥的方法

浓缩：1、减压干燥浓缩法，是通过降低液面的压力使液体沸点降低，减压的真空度越高，沸点降得越低，蒸发越快。此法适用于一些不耐热的生物大分子及生物制品的浓缩。2、吸收法，是通过一种吸收剂直接吸收除去溶液中溶剂分子，是溶液浓缩的方法。使用的吸收剂必须与溶液不起化学反应，对生物大分子不起吸附租用，易与溶液分开，吸收剂除去溶剂后能反复使用（常用的是聚乙二醇）3、超滤法，是使用一种特制的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法。通过超滤法，蛋白质和酶的稀释液一般可浓缩到10%~50%浓度，回收率高达90%。应用超滤法关键是在于滤膜的选择。干燥：1，真空干燥，适用于不耐高温、易氧化的物质的干燥和保存，其原理与减压浓缩相同，真空度越高，沸点降得越低，蒸发越快。2、冷冻真空干燥，又称为升华干燥，除利用真空干燥的原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压力随温度的下降而下降，故在低温低压下，冰很容易升华为气体。

基因工程产品一般需检测的指标

1、鉴别试验，2、外观，冷冻干燥制品应为白色薄壳疏松体。加入标量蒸馏水后应迅速溶解为澄明液体，不得含有肉眼可见的不溶物，3、化学检定4、pH值5、水分，一般冷冻干燥生物制品应不高于3%，6、效价测定7、无菌试验8、异常毒性试验9、蛋白质含量，一般用Lowry法测定10、比活性11、纯度，根据要求用电泳法和高效液相色谱法等12、分子量，一般用还原型SDS—PAGA法13、外源性DNA法残留量，一般用固相斑点杂交法，以地高辛标记的核酸探针法测定14、IgG残留量15、宿主蛋白残量，一般用酶联免疫法测定16、残余抗生素活性17、细菌内毒素含量18、等电点19、紫外光谱扫描20、肽图21、N—末端氨基酸序列。

菌种衰退的原因，防止措施和保存方法

原因：1、基因突变－－主要原因：有关基因发生负突变导致菌种衰退，表型延迟造成菌种衰退，质粒脱落导致菌种衰退，2、连续传代－－加速衰退，3、不适宜的培养和保藏条件－－加速衰退。防止措施：控制传代次数，菌种经常纯化，创造良好的培养条件，利用不易衰退的细胞移种传代，采用有效的菌种保藏方法，讲究菌种选育技术。保存方法：斜面低温保藏法，石蜡油封藏法，砂土管保藏法，麸皮保藏法，甘油悬液保藏法，冷冻真空干燥保藏法，液氮超低温保藏法，宿主保藏法

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/5b0f1e6d561252d380eb6eeb.html